Utilisation des cellules Drosophila S2 pour l'imagerie en direct de la division cellulaire
Summary
Les divisions cellulaires peuvent être visualisées en temps réel à l’aide de protéines étiquetées fluorescentes et de microscopie en accéléré. En utilisant le protocole présenté ici, les utilisateurs peuvent analyser la dynamique de synchronisation de division cellulaire, l’assemblage mitotique de fuseau, et le congrès et la ségrégation de chromosome. Les défauts dans ces événements suivant l’interférence d’ARN (RNAi)-négocié le gène knockdown peuvent être évalués et quantifiés.
Abstract
Drosophile Les cellules S2 sont un outil important dans l’étude de la mitose dans la culture tissulaire, fournissant des aperçus moléculaires dans ce processus cellulaire fondamental d’une manière rapide et à haut débit. Les cellules S2 se sont avérées favorables aux applications d’imagerie à cellules fixes et vivantes. Notamment, l’imagerie cellulaire vivante peut fournir des informations précieuses sur la façon dont la perte ou le renversement d’un gène peut affecter la cinétique et la dynamique des événements clés au cours de la division cellulaire, y compris l’assemblage de fuseaux mitotiques, le congrès chromosomique et la ségrégation, ainsi que calendrier global du cycle cellulaire. Ici, nous utilisons des cellules S2 poignardée transfecté avec fluorescent marqué mCherry: -tubulin pour marquer le fuseau mitotique et GFP:CENP-A (appelé «CID» gène dans Drosophila) pour marquer le centroromere pour analyser les effets des gènes mitotiques clés sur le moment de divisions cellulaires, de la prophase (en particulier à la rupture de l’enveloppe nucléaire; NEBD) au début de l’anaphase. Ce protocole d’imagerie permet également la visualisation du microtubule de fuseau et de la dynamique de chromosome tout au long de la mitose. Ici, nous visons à fournir un protocole simple mais complet qui permettra aux lecteurs d’adapter facilement les cellules S2 pour des expériences d’imagerie en direct. Les résultats obtenus à partir de telles expériences devraient élargir notre compréhension des gènes impliqués dans la division cellulaire en définissant leur rôle dans plusieurs événements simultanés et dynamiques. Les observations faites dans ce système de culture cellulaire peuvent être validées et étudiées plus en détail in vivo à l’aide de l’impressionnante boîte à outils d’approches génétiques chez les mouches.
Introduction
La Division cellulaire est un processus essentiel à tous les organismes multicellulaires, à la fois dans leur développement et l’homéostasie1. Drosophila a longtemps été utilisé comme un modèle pour l’étude de la division cellulaire, avec des expériences dans divers types de tissus et des conditions génétiques fournissant des informations clés sur le processus. Tandis que beaucoup de ces perspicacités proviennent des conditions fixes de cellules, la division de cellules est une procédure dynamique avec beaucoup de pièces mobiles, faisant la visualisation des cellules vivantes faisant partie intégrante à évaluer des effets de KNOCK ou génétiques sur de nombreuses parties de la division cellulaire, y compris formation de fuseau, pléinochromosome et ségrégation, et cytokinesis.
De nombreux protocoles ont été développés et utilisés au fil des ans pour visualiser les divisions cellulaires drosophila in vivo. Divers groupes ont cultivé des techniques pour les divisions d’image dans les disques imaginaires larvaires et les cerveaux larvaires2,3,4,5,6,7,8 . Ces techniques, bien qu’utiles pour l’imagerie dans des tissus spécifiques, sont limitées dans le débit et nécessitent souvent la génération et le maintien des stocks génétiques pour générer des composants fluorescents et modifier l’expression des gènes d’intérêt. Les cellules S2 cultivées de Drosophila offrent une alternative de débit plus élevée pour tester rapidement les effets de divers gènes dans la division cellulaire. En outre, avec la capacité de transfect diverses protéines fluorescentes, les cellules S2 peuvent être rapidement modifiées pour déterminer les effets de knockdown d’ARNi sur de nombreux composants de la division cellulaire. Les gènes d’intérêt étiquetés fluorescents peuvent également être observés dans la division cellulaire, permettant une caractérisation dynamique de leur fonction9.
Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour l’imagerie en direct des cellules Mitotiques S2 en utilisant des méthodes que nous avons récemment décrit10. Notre méthode utilise des cellules transfectées stablement avec des marqueurs fluorescents pour les microtubules et les centromères dont l’expression est sous le contrôle d’un promoteur inductible de cuivre (metallothionein; pMT). Cette méthodologie peut être utilisée pour imager le fuseau et la dynamique chromosomique dans toutes les phases de la mitose en utilisant un microscope fluorescent relativement simple avec un logiciel d’imagerie de base. Il peut être encore personnalisé pour répondre aux besoins individuels de recherche, avec la transfection transitoire et l’ARNi offrant des possibilités élargies pour déterminer le rôle des gènes candidats dans la mitose. En raison de la relative simplicité du protocole, il peut être utilisé pour les écrans de perte de fonction à petite échelle pour identifier les gènes pour lesquels une étude plus approfondie in vivo serait bénéfique, permettant des efforts plus ciblés et l’efficacité avec la génétique ultérieure manipulation chez les mouches.
Protocol
Representative Results
Discussion
Identifier une cellule appropriée
La clé de l’imagerie en divisant les cellules S2 consiste d’abord à localiser la cellule appropriée. Le temps peut être gaspillé cellules d’imagerie qui sont pensés à tort pour être prêt à diviser, mais ne parviennent pas à le faire dans un délai raisonnable. Les cellules doivent être identifiées qui ont deux centrosomes distincts et visibles et un noyau intact. Les centrosomes doivent avoir des fibres de microtubule émanant d’eux, leur donnant un aspect “star-like”. Un noyau intact réfracte la lumière lors de l’ajustement de la mise au point, et rend également le centre approximatif de la cellule plus sombre en apparence. Le noyau contiendra également les « points » GFP:CID, une autre caractéristique distinctive pour l’aider à identifier. Les cellules avec des centrosomes de ‘gt;2, la ponctua de tubulin sans fibres de tubulin émanant d’eux, ou les cellules avec un seul centrosome devraient être évitées. En outre, si deux centrosomes sont visibles, mais qu’un noyau ne l’est pas, l’ONÉa l’a déjà eu lieu et la cellule est trop avancée dans sa division pour être imagenée si une analyse complète de la phase M est souhaitée. Une fois qu’une cellule appropriée est trouvée, la vitesse dans le démarrage de l’imagerie est cruciale car l’ONÉse se produit rapidement (généralement dans les 3-5 minutes) et retarder le début de l’imagerie peut conduire à des occasions manquées. Concentrez la cellule dans le logiciel d’imagerie rapidement de telle sorte que les deux centrosomes sont visibles, ou si les centrosomes sont hors du plan les uns avec les autres, définiz le point focal entre les deux, de sorte que chacun peut être capturé lorsque les piles Z sont recueillies au-dessus et au-dessous du centre défini moment. Une fois concentré, placez immédiatement le décalage entre la scène et la surface de la chambre cellulaire vivante à l’aide de la vérification de la mise au point infrarouge (si disponible) et commencez le programme d’imagerie. Bien que le protocole présenté ici soit spécifiquement conçu pour les expériences évaluant la dynamique DEBD à anaphase, de simples modifications pourraient convenir aux lecteurs qui étudient d’autres événements mitotiques. Pour l’imagerie NEBD-à-métaphase et anaphase-à-télophase, nous suggérons des intervalles de capture d’image de 10 s car ces processus sont fortement dynamiques et se produisent rapidement dans les cellules S2 (5-10 min). La transition de métaphase à anaphase (notre foyer expérimental typique) est un processus plus long (20-30 min) dans les cellules S2, et nous recueillons des images à des intervalles de 30 s. Enfin, la télophase-par-cytokinesis se produit assez lentement dans les cellules de S2, et nous suggérons des intervalles de 60 s fournissant la résolution assez pour ce processus approximatif d’heure-long.
Maintenir l’accent tout au long du programme d’imagerie
Si un dispositif de vérification de la mise au point infrarouge n’est pas disponible, assurez-vous d’éviter de heurter le microscope ou la table sur laquelle il repose, car cela peut entraîner le déplacement de la cellule hors de mise au point pendant le programme d’imagerie, conduisant à des résultats ambigus et inétables. Pré-enduit les puits de chambre cellulaire vivante avec Poly-L-lysine peut aider à l’adhérence cellulaire, ce qui peut aider à éviter le mouvement cellulaire et est particulièrement utile pour les configurations sans contrôles de mise au point infrarouge. En outre, les configurations, y compris les plates-formes absorbantes de choc ou les tables d’air, peuvent aider à éviter que les cellules ne se concentrent. Enfin, certains logiciels ont des fonctions de pause permettant à l’utilisateur de se recentrer et de reprendre le programme.
Imagerie des cellules multiples
Utile à l’accumulation de données est que souvent plusieurs cellules prêtes à se diviser peuvent être placées dans le même champ de vision pour l’imagerie. Cela peut être particulièrement utile pour les expériences dans lesquelles les cellules ont de longues durées de phase M ou une arrestation prolongée (par exemple, des conditions qui induisent l’activation du SAC). Pour ces cellules, nous avons généralement l’image jusqu’à ce que les cellules sont photobleached (environ 2-3 h), mais le calendrier complet des cellules arrêtées devrait être à la discrétion du chercheur. Parfois, les cellules de pré-division multiples peuvent être dans différents plans focaux, auquel cas il peut être utile d’ajouter des z-stacks pour accueillir toutes les cellules. L’ajout de plus de piles z peut également aider à améliorer la résolution. La prudence doit être prise en faisant ceci, cependant, car il exposera des cellules à plus de rayonnement et mènera au photobleaching plus rapide, aussi bien que mener à de grandes tailles de fichier sur des dispositifs de stockage de disque dur.
Éviter le blanchiment de photos et la phototoxicité
Notre méthode décrit des paramètres spécifiques pour les temps d’exposition, les intervalles d’imagerie, les piles z, et la transmission pour cent pour notre source de lumière LED qui fonctionnent généralement pour notre configuration expérimentale et les résultats souhaités. Comme les microscopes et les objectifs expérimentaux peuvent varier, ce qui pourrait bien fonctionner pour notre système peut conduire à un blanchiment prématuré ou phototoxicité chez d’autres. Photodamage peut présenter un manque de mouvement de fuseau, fragmentation de microtubule, dynamique défectueuse de microtubule, et activation prolongée de point de contrôle de fuseau. Une méthode potentielle pour éviter de tels pièges est de limiter le temps d’exposition. La plupart des caméras modernes possèdent maintenant de larges gammes dynamiques, et les histogrammes peuvent être ajustés pour visualiser les structures, même à des expositions très faibles. Une autre technique consiste à augmenter l’intervalle d’imagerie (p. ex., à plusieurs minutes entre les images) de sorte que le nombre de fois qu’une cellule est exposée à la lumière sur un intervalle de collecte total est réduit. Ceci est avantageux en particulier dans l’imagerie pour de plus longues périodes de temps (plusieurs heures), et peut en outre aider à diminuer la taille des fichiers de ces expériences. Limiter le nombre de piles z prises peut également aider à réduire l’exposition à la lumière, en utilisant 2 ou même seulement 1 au lieu de 3. De plus, l’ajustement de la transmission en pourcentage de la lumière (pour les sources lumineuses LED) ou l’utilisation de filtres à densité neutre (ND) (pour les sources de lumière Halogen Lamp et LED) diminueront l’intensité lumineuse et couplés à des temps d’exposition plus longs peuvent préserver la visibilité . En choisissant des cellules avec des centrosomes déjà séparés, l’exposition globale peut être limitée en ce que ces cellules entrent habituellement dans la mitose rapidement (dans une minute ou deux) après le début de la formation image. On peut également limiter le temps que les cellules sont autorisées à être photographiés avant L’ONÉ. Notre laboratoire fixe généralement cette fois à 10 min, mais une limite plus conservatrice peut facilement être imposée par l’utilisateur. En outre, une mesure plus «invasive» que nous recommandons est le traitement avec dsRNA ciblée contre une composante de la SAC (comme Rod ou Mad2). Si un phénotype d’arrestation est dû à des dommages cellulaires non spécifiques (p. ex., la dynamique défectueuse des microtubules), un tel traitement est moins susceptible de supprimer l’arrestation que d’un effet de bonne foi du gène d’intérêt dans l’expérience originale.
Orientations futures
La méthode décrite ici peut être utilisée sur un microscope épifluorescent relativement simple pour imager rapidement les divisions cellulaires vivantes et peut être facilement adaptée à la conception et aux objectifs expérimentaux particuliers d’un chercheur. Plusieurs excellentes méthodes de culture, approches knockdown RNAi, transfection transitoire, et microscopie fluorescence ont été publiés pour S2 et d’autres cellules Drosophila 9,14,15, 16 Annonces , 17. Notre protocole offre quelques avantages. (1) L’utilisation d’une double lignée cellulaire stable (GFP:CID, mCherry: ‘Tubulin) marque simultanément deux structures mitotiques clés, évite les tracas et les complications potentielles de la transfection transitoire, et assure que presque toutes les cellules exprimeront des marqueurs fluorescents comme candidats potentiels à l’imagerie. (2) L’adaptation à la mitose s’ajoute aux protocoles publiés examinant la dynamique cytosquelettique dans les cellules motiles et non-divisantes et s’étend à l’examen des événements mitotiques en temps réel. Bien que nous croyions que la nôtre est une technique puissante qui ajoute au répertoire des autres, il peut toujours y avoir des améliorations apportées. Un domaine particulier de la division cellulaire que nous avons trouvé difficile à image est la division centrosome. Cela se produit avant l’ONÉ Et il est difficile de déterminer quand un seul centrosome est prêt à se séparer en deux. L’utilisation de marqueurs de cycle cellulaire fluorescent (Cyclin A et Cyclin B) pourrait aider à résoudre ce problème, mais se fait au détriment des canaux qui pourraient être utilisés pour visualiser les composants de la division cellulaire. Notre meilleure stratégie pour tenter de visualiser la division centrosome est d’ajouter l’acquisition multipoint au programme d’imagerie (définir différents points dans le plan XY à l’image), mais cela peut entraîner des fichiers volumineux, et peut également exiger (selon le nombre de points) augmenter l’intervalle entre la collecte d’images, en diminuant la résolution temporelle du film résultant. Une autre solution pourrait être la synchronisation des cellules à un stade de cycle cellulaire souhaité à l’aide de médicaments qui ciblent les régulateurs du cycle cellulaire suivie s’ils ont suivi le lavage avant l’imagerie, bien que ces méthodes puissent ne pas être fiables dans les cellules S2 en particulier.
Le protocole présenté ici fournit une base pour de futures applications dans l’imagerie cellulaire vivante ainsi. Grâce à l’amélioration de la technologie d’imagerie et de logiciels, des adaptations vraiment à haut débit de ce protocole utilisant une capacité plus élevée, des plaques à plusieurs chambres pourraient être possibles. De telles innovations rendraient les écrans RNAi à grande échelle, tels que ceux déjà réalisés dans les préparations fixes12,18, plus traitables dans un format de cellule en direct. Les écrans de médicaments à petites molécules pourraient également être envisagés comme un moyen d’identifier de nouveaux composés ciblant les processus de division cellulaire. L’amélioration des fluorophores et des filtres optiques pourrait également mener à l’imagerie de composants mitotiques multiples (pas seulement les deux que nous décrivons), permettant l’imagerie de régulateurs mitotiques spécifiques et de leurs interactions avec l’ADN et/ou le fuseau. Par exemple, la génération de cellules avec des reporters fluorescents qui expriment après les dommages à l’ADN ou pendant l’apoptose serait des outils utiles pour identifier les nouveaux gènes impliqués dans ces processus. Des approches similaires pourraient être utilisées pour examiner la dynamique du cycle cellulaire à l’aide de cyclins étiquetés fluorescents19.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ces travaux ont été financés par les National Institutes of Health (R01 GM108756). Nous sommes reconnaissants à Gary Karpen (Université de Californie, Berkeley) pour nous fournir généreusement un gFP:CID S2 stock de lignée cellulaire à partir de laquelle notre GFP:CID / mCherry: Tubulin ligne a été générée10.
Materials
| Bright-Line Hemacytometer | Sigma-Aldrich | Z359629-1EA | for cell counting |
| cellSens imaging software | Olympus | ||
| CELLSTAR Cell Culture Flask, 50ML, 25 CM2, PS, Red Filter Screw Cap, Clear, Sterile, 10PCS/BAG | Greiner Bio-One | 690175 | |
| CELLSTAR Cell Culture Multiwell Plate, 6 well, PS, Clear, TC, Lid with condensation rings, sterile, single packed | Greiner Bio-One | 657160 | |
| Centrifuge 5804 R | eppendorf | Cat. 022623508 | |
| Copper(II) sulfate pentahydrate, minimum 98% | Sigma-Aldrich | C3036-250G | |
| Corning Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | MT35015CV | |
| Effectene Transfection Reagent 1 mL | Qiagen | 301425 | for transient transfection |
| IX-83 Inverted Epifluorescent Microscope | Olympus | ||
| LabTek Chambered Slide Insert | Applied Scientific Instruments | I-3016 | |
| MEGAscript T7 Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1334 | For dsRNA production |
| MOXI Z Mini Automated Cell Counter Kit | ORFLO | MXZ001 | for cell counting |
| MS-2000 XY Flat-Top Automated Stage and Controller | Applied Scientific Instruments | ||
| Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass (no 1.5 borosilicate glass) 8-well | Thermo Fisher Scientific | 155409 | |
| Orca-Flash 4.0 LT Camera | Hammamatsu Photonics K.K. | C11440-42U | |
| pMT/V5-His A Drosophila Expression Vector | Thermo Fisher Scientific | V412020 | |
| Poly-L-Lysine | Cultrex | 3438-100-01 | |
| Purifier Logic+ Class II, Type A2 Biosafety Cabinets | Labconco | 302310000 | |
| Schneider's insect medium | Sigma-Aldrich | S0146-100ML | |
| Spectra Tub Centrifuge Tubes | VWR | 470224-998 | |
| Uner Counter BOD Incubator | Sheldon manufacturing (VWR) | 89409-346 | |
| X-CITE 120 LED | ExcelitasTechnologies | Led light source | |
| Z -Drift Compensator (ZDC) | Olympus | infrared focus check |
References
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