Hücre Bölünmesi Canlı Görüntüleme için Drosophila S2 Hücrelerinin Kullanımı
Summary
Hücre bölünmeleri floresan etiketli proteinler ve zaman atlamalı mikroskopi kullanılarak gerçek zamanlı olarak görüntülenebilir. Burada sunulan protokolü kullanarak, kullanıcılar hücre bölünmesi zamanlama dinamiklerini, mitotik mil montajını ve kromozom kongresini ve segregasyonlarını analiz edebilirler. RNA girişimini (RNAi) aracılı gen nakavtı sonrası bu olaylardaki kusurlar değerlendirilebilir ve ölçülebilir.
Abstract
Drosophila S2 hücreleri doku kültüründe mitoz çalışmada önemli bir araçtır, hızlı ve yüksek iş lenme şekilde bu temel hücresel sürecin moleküler anlayışlar sağlayan. S2 hücreleri hem sabit hem de canlı hücre görüntüleme uygulamalarına uygun olduğunu kanıtlamıştır. Özellikle, canlı hücre görüntülemesi, bir genin kaybolması veya yıkılmasının hücre bölünmesi sırasında kinetiği ve dinamiklerini nasıl etkileyebileceği hakkında değerli bilgiler verebilir, mitotik mil montajı, kromozom kongresi ve segregasyon gibi genel hücre döngüsü zamanlaması. Burada, mitotik iğ ve GFP:CENP-A (Drosophila’da‘CID’ geni olarak anılacaktır) işaretlemek için floresan etiketli mCherry:α-tubulin ile transfeced S2 hücrelerini kullanıyoruz. hücre bölünmeleri, profazdan (özellikle Nükleer Zarf Dökümünde; NEBD) anafaz başlangıcına. Bu görüntüleme protokolü aynı zamanda mitoz boyunca iğ mikrotübülve kromozom dinamiğinin görüntülenmesi için izin verir. Burada, okuyucuların Canlı görüntüleme deneyleri için S2 hücrelerini kolayca uyarlamalarına olanak sağlayacak basit ama kapsamlı bir protokol sağlamayı amaçlıyoruz. Bu tür deneylerden elde edilen sonuçlar, eşzamanlı ve dinamik olaylardaki rollerini tanımlayarak hücre bölünmesinde yer alan genleri anlamamızı genişletmelidir. Bu hücre kültür sisteminde yapılan gözlemler, sineklerde genetik yaklaşımların etkileyici araç seti kullanılarak in vivo olarak doğrulanabilir ve araştırılabilir.
Introduction
Hücre Bölünmesi tüm çok hücreli organizmalar için kritik bir süreçtir,hem gelişim leri hem de homeostaz1. Drosophila uzun hücre bölünmesi çalışmaları için bir model olarak kullanılmıştır, çeşitli doku tipleri ve genetik koşullar süreci içine anahtar anlayışlar sağlayan deneyler ile. Bu öngörülerin çoğu sabit hücre koşullarından gelirken, hücre bölünmesi birçok hareketli parçaile dinamik bir işlemdir, canlı hücrelerin görselleştirilmesini rnai veya genetik nakavt etkilerini hücre bölünmesinin çeşitli bölümleri üzerinde değerlendirmek için entegre hale getirir, iğ oluşumu, kromozom kongre ve segregasyon ve sitokinez.
Drosophila hücre bölünmelerini in vivo görselleştirmek için yıllar içinde birçok protokol geliştirilmiş ve kullanılmıştır. Çeşitli gruplar hem larva imaginal diskler ve larva beyinleri2,3,4,5,6,7,8 görüntü bölümleri için teknikler ekili var . Bu teknikler, belirli dokularda görüntüleme için yararlı olsa da, üretim sınırlıdır ve genellikle floresan bileşenleri oluşturmak ve ilgi genlerin ifadesini değiştirmek için genetik stokların üretimi ve bakımı gerektirir. Drosophila’dan kültürlü S2 hücreleri, hücre bölünmesindeki çeşitli genlerin etkilerini hızla test etmek için daha yüksek bir üretim alternatifi sağlar. Ayrıca, çeşitli floresan proteinler transfect yeteneği ile, S2 hücreleri hızlı bir şekilde hücre bölünmesi çok sayıda bileşenleri üzerinde RNAi knockdown etkilerini belirlemek için değiştirilebilir. Floresan etiketli genler de hücre bölünmesi gözlenebilir, onların fonksiyonudinamik karakterizasyonu için izin9.
Burada mitotik S2 hücrelerinin canlı görüntülemesi için detaylıbir protokol salıyoruz. Yöntemimiz, ekspresyonu bakır indükleyici bir promotor (metallothionein; pMT) kontrolü altında olan mikrotübüller ve sentromerler için floresan belirteçleri olan stably transfected hücreleri kullanır. Bu metodoloji, temel görüntüleme yazılımı ile nispeten basit bir floresan mikroskobu kullanarak mitozun tüm evrelerinde mil ve kromozom dinamiklerini görüntülemek için kullanılabilir. Geçici transfeksiyon ve RNAi mitozda aday genlerin rolünü belirlemek için genişletilmiş olanaklar sunarak, bireysel araştırma ihtiyaçlarına uyacak şekilde daha da özelleştirilebilir. Protokolün göreceli basitliği nedeniyle, daha ileri çalışmalarda in vivo yararlı olacak genleri belirlemek için küçük ölçekli fonksiyon kaybı ekranlar için kullanılabilir, sonraki genetik ile daha odaklı çaba ve verimlilik için izin sinekmanipülasyon.
Protocol
Representative Results
Discussion
Uygun Bir Hücreyi Tanımlama
S2 hücrelerini bölen görüntülemenin anahtarı ilk olarak uygun hücreyi bulmaktır. Zaman yanlışlıkla bölmeye hazır olduğu düşünülen ancak makul bir zaman diliminde bunu başaramayan görüntüleme hücreleri boşa harcanan olabilir. İki farklı ve görünür centrozom ve sağlam bir çekirdeği olan hücreler tanımlanmalıdır. Centrosomes mikrotübül lifleri onlardan yayılan olmalıdır, onlara bir “yıldız gibi” bir görünüm veren. Sağlam bir çekirdek, odağı ayarlarken ışığı kırarak hücrenin yaklaşık merkezini görünüm olarak daha koyu hale getirir. Çekirdek aynı zamanda GFP:CID “nokta”, tanımlama yardımcı olmak için başka bir ayırt edici özelliği içerecektir. >2 centrozomlu hücreler, tübüsün liflerinden çıkan tübüsün pensaları veya sadece bir santrozomlu hücrelerden kaçınılmalıdır. Ayrıca, iki centrozsomes görünür, ancak bir çekirdek değilse, NEBD zaten oluştu ve hücre tam bir M-faz analizi istenirse görüntülenecek kendi bölümünde çok gelişmiştir. Uygun bir hücre bulunduktan sonra, NEBD hızlı bir şekilde (genellikle 3-5 dk içinde) oluştuğu ndan ve görüntülemenin başlamasını geciktirme kaçırılan fırsatlara yol açabileceğinden, görüntülemeye başlama hızı çok önemlidir. Her iki centrozsomes görünür, ya da centrozsomes birbirleri ile düzlem dışında ise, her z yığınları yukarıda ve tanımlanan merkezi altında toplandığında her biri yakalanabilir şekilde, böylece görüntüleme yazılımı nda hızlı bir şekilde hücre odaklanın Nokta. Bir kez odaklanmış, hemen kızılötesi odak kontrolü (varsa) kullanarak sahne ve canlı hücre odası yüzeyi arasında ofset ayarlayın ve görüntüleme programı başlar. Burada sunulan protokol, NEBD-anafaz dinamiklerini değerlendiren deneyler için özel olarak tasarlanmış olsa da, basit değişiklikler alternatif mitotik olayları inceleyen okuyuculara uygun olabilir. NEBD-metafaz ve anafazdan telofaz görüntülemede, bu süreçler son derece dinamik olduğundan ve S2 hücrelerinde (5-10 dk) hızlı bir şekilde meydana geldiğinden 10 s görüntü yakalama aralıkları öneriyoruz. Metafaz-anafaz geçişi (tipik deneysel odak) S2 hücrelerinde daha uzun bir süreçtir (20-30 dk) ve görüntüleri 30 s aralıklarla toplarız. Son olarak, telofaz-through-sitokinez S2 hücrelerinde oldukça yavaş oluşur, ve biz 60 s aralıkları bu yaklaşık bir saat süren süreç için yeterli çözünürlük sağlayan öneririz.
Görüntüleme Programı Boyunca OdağıN Korunması
Kızılötesi odak lama kontrol aygıtı kullanılamıyorsa, hücrenin görüntüleme programı sırasında odak tan uzaklaşmasına ve belirsiz, yorumlanamayan sonuçlara yol açabileceğinden, mikroskobu veya üzerine oturduğu tabloyu çarpmaktan kaçındığından emin olun. Canlı hücre odası kuyularının Poli-L-lizin ile önceden kapılması hücre yapışmasında yardımcı olabilir, bu da hücre hareketini önlemeye yardımcı olabilir ve özellikle kızılötesi odak kontrolü olmayan kurulumlar için yararlıdır. Ayrıca, şok emici platformlar veya hava tabloları da dahil olmak üzere kurulumlar, hücrelerin odak dışında hareket ettiğini önlemeye yardımcı olabilir. Son olarak, bazı yazılım programları, kullanıcının programı yeniden odaklamasını ve devam etmesini sağlayan duraklatma işlevlerine sahiptir.
Birden Fazla Hücre Görüntüleme
Veri birikmesi için yararlı genellikle birden fazla hücre bölmek için hazır görüntüleme için görüş aynı alan içinde yerleştirilebilir olmasıdır. Bu durum, özellikle hücrelerin uzun M faz sürelerine veya uzun süreli tutuklamaya sahip olduğu deneyler için yararlı olabilir (örneğin, SAC’Nin aktivasyonuna neden olan durumlar). Bu hücreler için, genellikle hücreler fotobeyazlama kadar görüntü (yaklaşık 2-3 saat), ancak tutuklanan hücrelerin tam zamanlaması araştırmacının takdirine bağlı olmalıdır. Bazen birden çok önceden bölen hücreler farklı odak düzlemlerinde olabilir, bu durumda tüm hücreleri barındıracak z yığınları eklemek yararlı olabilir. Daha fazla z yığınları eklemek de çözünürlüğü geliştirmeye yardımcı olabilir. Ancak, hücreleri daha fazla radyasyona maruz bırakacağı ve daha hızlı fotobeyazrlamaya yol açacağı ve sabit disk depolama aygıtlarında büyük dosya boyutlarına yol açacağı için, bunu yaparken dikkatli olunmalıdır.
Fotobeyaztma ve Fototoksisiteden Kaçınma
Yöntemimiz, genellikle deneysel kurulumumuz ve istenen sonuçlar için çalışan LED ışık kaynağımız için pozlama süreleri, görüntüleme aralıkları, z yığınları ve yüzde iletimi için belirli ayarları açıklar. Mikroskoplar ve deneysel hedefler değişebildikçe, sistemimiz için iyi nelerin işe yarayacağı, diğerlerinde erken fotobeyazrlama veya fototoksisiteye yol açabilir. Fotohasar, mil hareketi, mikrotübül parçalanması, kusurlu mikrotübül dinamiği ve uzun süreli mil kontrol noktası aktivasyonu eksikliğini ortaya çıkabilir. Bu tür tuzakları önlemek için bir potansiyel yöntem pozlama süresini sınırlamaktır. Modern fotoğraf makinelerinin çoğu artık geniş dinamik aralıklara sahiptir ve histogramlar çok düşük pozlamalarda bile yapıları görselleştirecek şekilde ayarlanabilir. Başka bir teknik, bir hücrenin toplam toplama aralığı boyunca ışığa maruz kalma sayısının azaldığı görüntüleme aralığını (örn. görüntüler arasında birkaç dakikaya) artırmaktır. Bu, özellikle daha uzun süreler (birkaç saat) görüntüleme açısından avantajlıdır ve ayrıca bu tür denemelerin dosya boyutunun azaltılmasına yardımcı olabilir. Alınan z yığınlarının sayısını sınırlamak, 3 yerine 2 hatta sadece 1 kullanarak ışığa maruz kalmanın azaltılmasına da yardımcı olabilir. Ayrıca, ışığın yüzde iletimini ayarlamak (LED ışık kaynakları için) veya nötr yoğunluklu (ND) filtrelerinin kullanılması (halojen lamba ve LED ışık kaynakları için) ışık yoğunluğunu azaltacak ve daha uzun pozlama süreleri ile birleştiğinde görüş mesafesi korunabilir . Centrozomlar zaten ayrılmış hücreleri seçerek, genel maruz kalma genellikle hızlı bir şekilde mitoz girin sınırlı olabilir (bir veya iki dakika içinde) görüntüleme başladıktan sonra. Bir de hücrelerin NEBD önce görüntülenebilir izin verilen süreyi sınırlayabilirsiniz. Bizim laboratuvar genellikle 10 dakika bu kez ayarlar, ancak daha muhafazakar bir sınır kolayca kullanıcı tarafından empoze edilebilir. Ayrıca, tavsiye ettiğimiz daha ‘invaziv’ bir tedbir SAC bileşeni (Rod veya Mad2 gibi) karşı hedeflenen dsRNA ile tedavi edilir. Eğer bir tutuklama fenotipnon non-spesifik hücre hasarı (örneğin, kusurlu mikrotübül dinamikleri) nedeniyle ise, böyle bir tedavi orijinal deneyde ilgi geninin iyi niyetli bir etkisi ile karşılaştırıldığında tutuklama bastırmak için daha az olasıdır.
Gelecek Yönler
Burada açıklanan yöntem, canlı hücre bölünmelerini hızla görüntülemek için nispeten basit bir epifloresan mikroskopta kullanılabilir ve bir araştırmacının özel deneysel tasarımına ve hedeflerine kolayca uyarlanabilir. Culturing için çeşitli mükemmel yöntemler, RNAi knockdown yaklaşımlar, geçici transfeksiyon, ve floresan mikroskopi S2 ve diğer Drosophila hücreleri için yayınlanmıştır9,14,15, 16.02.20 , 17– Protokolümüz birkaç avantaj sunar. (1) Çift kararlı hücre hattı (GFP:CID, mCherry:α-Tubulin) kullanımı aynı anda iki temel mitotik yapıyı işaretler, geçici transfeksiyonun güçlük ve olası komplikasyonlarını önler ve hemen hemen tüm hücrelerin floresan belirteçleri görüntüleme için potansiyel adaylar. (2) Mitoz bölünmeye adaptasyon, hareketli, bölünmeyen hücrelerdeki sitoskeletal dinamikleri inceleyen yayınlanmış protokollere katkıda bulunur ve mitotik olayların gerçek zamanlı olarak incelenmesine kadar uzanır. Biz bizim başkalarının repertisi ekler güçlü bir teknik olduğuna inanıyoruz, her zaman iyileştirmeler yapılabilir. Hücre bölünmesinin görüntülenmede zor bulduğumuz belirli bir alanı da centrozsome bölümüdür. Bu NEBD önce oluşur ve tek bir centrozsome ikiye ayırmaya hazır olup olmadığını belirlemek zordur. Floresan hücre döngüsü işaretleyicileri (Cyclin A ve Cyclin B) kullanarak bu sorunu çözmeye yardımcı olabilir, ancak hücre bölünmesi bileşenleri görselleştirmek için kullanılabilecek kanalların pahasına gelir. Centrozsome bölümü görselleştirmek için denemek için en iyi strateji görüntüleme programına çok noktalı edinimi eklemektir (görüntü xy düzleminde farklı noktaları tanımlayan), ama bu büyük dosyalar neden olabilir, ve aynı zamanda (puan sayısına bağlı olarak) gerektirebilir görüntü toplama arasındaki aralığı artırmak, ortaya çıkan filmin zaman çözünürlüğünü azaltmak. Başka bir çözüm, hücre döngüsü regülatörlerini hedef alan ve görüntüleme den önce sonraki yıkamayı takip eden ilaçlar kullanılarak istenilen hücre döngüsü aşamasında hücrelerin senkronizasyonu olabilir, ancak bu yöntemler özellikle S2 hücrelerinde güvenilir olmayabilir.
Burada sunulan protokol, canlı hücre görüntülemede de gelecekteki uygulamalar için bir temel sağlamaktadır. Gelişmiş görüntüleme ve yazılım teknolojisi ile, daha yüksek kapasiteli bu protokolün gerçekten yüksek iş getiriyi uyarlamaları ile, çok odalı plakalar mümkün olabilir. Bu tür yenilikler büyük ölçekli RNAi ekranlar yapacak, bu zaten sabit hazırlıklar elde gibi12,18, canlı hücre formatında daha fazla çekilebilir. Küçük moleküllü ilaç ekranları da hücre bölünmesi süreçlerini hedefleyen yeni bileşiklerin belirlenmesi için bir araç olarak öngörülebilir. Florofororların ve optik filtrelerin iyileştirilmesi, belirli mitotik regülatörlerin ve bunların DNA ve/veya mil ile etkileşimlerinin görüntülenmesine olanak sağlayarak birden fazla mitotik bileşenin (sadece tanımladığımız iki bileşenin değil) görüntülenmesine de yol açabilir. Örneğin, DNA hasarı nın ardından veya apoptoz sırasında ifade floresan muhabirler ile hücre üreten bu süreçlerde yer alan yeni genleri tanımlamak için yararlı araçlar olacaktır. Benzer yaklaşımlar floresan etiketli siklinler19ifadesini kullanarak hücre döngüsü dinamikleri incelemek için kullanılabilir.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (R01 GM108756) tarafından finanse edilmiştir. Biz Gary Karpen (University of California, Berkeley) cömertçe bir GFP: CID S2 hücre hattı stok hangi bizim GFP: CID / mCherry:αTubulin hattı10oluşturuldu bize sağladığı için minnettarız.
Materials
| Bright-Line Hemacytometer | Sigma-Aldrich | Z359629-1EA | for cell counting |
| cellSens imaging software | Olympus | ||
| CELLSTAR Cell Culture Flask, 50ML, 25 CM2, PS, Red Filter Screw Cap, Clear, Sterile, 10PCS/BAG | Greiner Bio-One | 690175 | |
| CELLSTAR Cell Culture Multiwell Plate, 6 well, PS, Clear, TC, Lid with condensation rings, sterile, single packed | Greiner Bio-One | 657160 | |
| Centrifuge 5804 R | eppendorf | Cat. 022623508 | |
| Copper(II) sulfate pentahydrate, minimum 98% | Sigma-Aldrich | C3036-250G | |
| Corning Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | MT35015CV | |
| Effectene Transfection Reagent 1 mL | Qiagen | 301425 | for transient transfection |
| IX-83 Inverted Epifluorescent Microscope | Olympus | ||
| LabTek Chambered Slide Insert | Applied Scientific Instruments | I-3016 | |
| MEGAscript T7 Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1334 | For dsRNA production |
| MOXI Z Mini Automated Cell Counter Kit | ORFLO | MXZ001 | for cell counting |
| MS-2000 XY Flat-Top Automated Stage and Controller | Applied Scientific Instruments | ||
| Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass (no 1.5 borosilicate glass) 8-well | Thermo Fisher Scientific | 155409 | |
| Orca-Flash 4.0 LT Camera | Hammamatsu Photonics K.K. | C11440-42U | |
| pMT/V5-His A Drosophila Expression Vector | Thermo Fisher Scientific | V412020 | |
| Poly-L-Lysine | Cultrex | 3438-100-01 | |
| Purifier Logic+ Class II, Type A2 Biosafety Cabinets | Labconco | 302310000 | |
| Schneider's insect medium | Sigma-Aldrich | S0146-100ML | |
| Spectra Tub Centrifuge Tubes | VWR | 470224-998 | |
| Uner Counter BOD Incubator | Sheldon manufacturing (VWR) | 89409-346 | |
| X-CITE 120 LED | ExcelitasTechnologies | Led light source | |
| Z -Drift Compensator (ZDC) | Olympus | infrared focus check |
References
- Ragkousi, K., Gibson, M. C. Cell division and the maintenance of epithelial order. Journal of Cell Biology. 207 (2), 181-188 (2014).
- Aldaz, S., Escudero, L. M., Freeman, M. Live imaging of Drosophila imaginal disc development. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 107 (32), 14217-14222 (2010).
- Cabernard, C., Doe, C. Q. Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila. Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (10), 970-977 (2013).
- Lerit, D. A., Plevock, K. M., Rusan, N. M. Live imaging of Drosophila larval neuroblasts. Journal of Visualized Experiments. (89), (2014).
- Morris, L. X., Spradling, A. C. Long-term live imaging provides new insight into stem cell regulation and germline-soma coordination in the Drosophila ovary. Development. 138 (11), 2207-2215 (2011).
- Prasad, M., Jang, A. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. A protocol for culturing Drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging. Nature Protocols. 2 (10), 2467-2473 (2007).
- Restrepo, S., Zartman, J. J., Basler, K. Cultivation and Live Imaging of Drosophila Imaginal Discs. Methods in Molecular Biology. 1478, 203-213 (2016).
- Tsao, C. K., Ku, H. Y., Lee, Y. M., Huang, Y. F., Sun, Y. H. Long Term Ex Vivo Culture and Live Imaging of Drosophila Larval Imaginal Discs. PLoS One. 11 (9), e0163744 (2016).
- Rogers, S. L., Rogers, G. C. Culture of Drosophila S2 cells and their use for RNAi-mediated loss-of-function studies and immunofluorescence microscopy. Nature Protocols. 3 (4), 606-611 (2008).
- Dewey, E. B., Johnston, C. A. Diverse mitotic functions of the cytoskeletal cross-linking protein Shortstop suggest a role in Dynein/Dynactin activity. Molecular Biology of the Cell. 28 (19), 2555-2568 (2017).
- Rodriguez, E. A., et al. The Growing and Glowing Toolbox of Fluorescent and Photoactive Proteins. Trends in Biochemical Sciences. 42 (2), 111-129 (2017).
- Kwon, M., et al. Mechanisms to suppress multipolar divisions in cancer cells with extra centrosomes. Genes and Development. 22 (16), 2189-2203 (2008).
- Basto, R., Gomes, R., Karess, R. E. Rough deal and Zw10 are required for the metaphase checkpoint in Drosophila. Nature Cell Biology. 2 (12), 939-943 (2000).
- Currie, J. D., Rogers, S. L. Using the Drosophila melanogaster D17-c3 cell culture system to study cell motility. Nature Protocols. 6 (10), 1632-1641 (2011).
- Lu, W., Del Castillo, U., Gelfand, I. V. Organelle transport in cultured Drosophila cells: S2 cell line and primary neurons. Journal of Visualized Experiments. (81), e50838 (2013).
- Yang, J., Reth, M. Drosophila S2 Schneider cells: a useful tool for rebuilding and redesigning approaches in synthetic biology. Methods in Molecular Biology. 813, 331-341 (2012).
- Zhou, R., Mohr, S., Hannon, G. J., Perrimon, N. Inducing RNAi in Drosophila cells by soaking with dsRNA. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (5), (2014).
- Goshima, G., et al. Genes required for mitotic spindle assembly in Drosophila S2 cells. Science. 316 (5823), 417-421 (2007).
- Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132 (3), 487-498 (2008).
