Einsatz von Drosophila S2-Zellen für Live Imaging of Cell Division
Summary
Zellteilungen können in Echtzeit mit fluoreszierend markierten Proteinen und Zeitraffermikroskopie visualisiert werden. Mithilfe des hier vorgestellten Protokolls können Benutzer die Timing-Dynamik der Zellteilung, die mitotische Spindelbaugruppe sowie den Chromosomenkongress und die Segregation analysieren. Defekte in diesen Ereignissen nach RNA-Interferenz (RNAi)-vermitteltem Genknockdown können bewertet und quantifiziert werden.
Abstract
Drosophila S2-Zellen sind ein wichtiges Werkzeug bei der Untersuchung der Mitose in der Gewebekultur und bieten molekulare Einblicke in diesen grundlegenden zellulären Prozess in einer schnellen und hochdurchsatzigen Weise. S2-Zellen haben sich sowohl für Fest- als auch für Live-Zell-Bildgebungsanwendungen bewährt. Insbesondere kann die Live-Zell-Bildgebung wertvolle Informationen darüber liefern, wie Verlust oder Knockdown eines Gens die Kinetik und Dynamik wichtiger Ereignisse während der Zellteilung beeinflussen kann, einschließlich mitotischer Spindelmontage, Chromosomenkongress und Segregation, sowie Gesamtzyklus-Timing. Hier verwenden wir S2-Zellen, die mit fluoreszierend mit dem Tag mCherry: -tubulin versehen sind, um die mitotische Spindel zu markieren, und GFP:CENP-A (in Drosophilaals “CID”-Gen bezeichnet), um das Zentromer zu markieren, um die Auswirkungen wichtiger mitotischer Gene auf das Timing der Zellteilungen, aus prophase (insbesondere bei Nuclear Envelope Breakdown; NEBD) zum Beginn der Anaphase. Dieses Bildgebungsprotokoll ermöglicht auch die Visualisierung der Spindelmikrotubuli- und Chromosomendynamik während der gesamten Mitose. Hierbei wollen wir ein einfaches, aber umfassendes Protokoll bereitstellen, das es den Lesern ermöglicht, S2-Zellen einfach für Live-Bildgebungsexperimente anzupassen. Die Ergebnisse solcher Experimente sollten unser Verständnis von Genen erweitern, die an der Zellteilung beteiligt sind, indem sie ihre Rolle in mehreren gleichzeitigen und dynamischen Ereignissen definieren. Beobachtungen in diesem Zellkultursystem können in vivo mit dem beeindruckenden Toolkit genetischer Ansätze bei Fliegen validiert und weiter untersucht werden.
Introduction
Cell Division ist ein Prozess, der für alle mehrzelligen Organismen kritisch ist, sowohl in ihrer Entwicklung als auch in der Homöostase1. Drosophila wird seit langem als Modell für die Untersuchung der Zellteilung verwendet, mit Experimenten in verschiedenen Gewebetypen und genetischen Bedingungen, die wichtige Einblicke in den Prozess liefern. Während viele dieser Erkenntnisse aus festen Zellbedingungen stammen, ist die Zellteilung ein dynamisches Verfahren mit vielen beweglichen Teilen, das die Visualisierung von lebenden Zellen zur Beurteilung von RNAi- oder genetischen Knockout-Effekten auf zahlreichen Teilen der Zellteilung, einschließlich Spindelbildung, Chromosom kongressund Segregation und Zytokinese.
Viele Protokolle wurden im Laufe der Jahre entwickelt und genutzt, um Drosophila-Zellteilungen in vivo zu visualisieren. Verschiedene Gruppen haben Techniken kultiviert, um Abteilungen in larval imaginalen Scheiben und Larven Gehirne2,3,4,5,6,7,8 . Diese Techniken sind zwar nützlich für die Bildgebung in bestimmten Geweben, sind aber im Durchsatz begrenzt und erfordern häufig die Erzeugung und Pflege genetischer Bestände, um fluoreszierende Komponenten zu erzeugen und die Expression von Genen von Interesse zu verändern. Kultivierte S2-Zellen von Drosophila bieten eine Alternative mit höherem Durchsatz, um die Wirkung verschiedener Gene in der Zellteilung schnell zu testen. Darüber hinaus können S2-Zellen mit der Fähigkeit, verschiedene fluoreszierende Proteine zu transfekten, schnell modifiziert werden, um die Auswirkungen des RNAi-Knockdowns auf zahlreiche Komponenten der Zellteilung zu bestimmen. Fluoreszierend markierte Gene von Interesse können auch in der Zellteilung beobachtet werden, was eine dynamische Charakterisierung ihrer Funktion9ermöglicht.
Hier bieten wir ein detailliertes Protokoll für die Live-Bildgebung von mitotischen S2-Zellen mit Methoden, die wir vor kurzem beschrieben10. Unsere Methode verwendet stabil transfizierte Zellen mit fluoreszierenden Markern für Mikrotubuli und Zentromere, deren Expression unter der Kontrolle eines kupferinduzierbaren Motors (Metallothionein; pMT) steht. Diese Methode kann verwendet werden, um Spindel- und Chromosomendynamik in allen Phasen der Mitose unter Verwendung eines relativ einfachen Fluoreszenzmikroskops mit basisgrundlegender Bildgebungssoftware abzubilden. Es kann weiter an die individuellen Forschungsbedürfnisse angepasst werden, wobei transiente Transfektion und RNAi erweiterte Möglichkeiten zur Bestimmung der Rolle von Kandidatengenen bei der Mitose bieten. Aufgrund der relativen Einfachheit des Protokolls kann es für kleinräumige Funktionsverlust-Bildschirme verwendet werden, um Gene zu identifizieren, für die weitere Studien in vivo von Vorteil wären, was eine gezieltere Anstrengung und Effizienz mit anschließenden genetischen Manipulation in Fliegen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Identifizieren einer geeigneten Zelle
Der Schlüssel zur Abbildung, die S2-Zellen teilt, ist zunächst die richtige Zelle zu lokalisieren. Zeit kann verschwendet werden Bildzellen, die fälschlicherweise angenommen werden, bereit zu teilen, aber nicht in einem angemessenen Zeitrahmen zu tun. Es müssen Zellen identifiziert werden, die zwei unterschiedliche und sichtbare Zentrosomen und einen intakten Kern haben. Centrosomen müssen Mikrotubulifasern haben, die von ihnen austreten, was ihnen ein “sternartiges” Aussehen verleiht. Ein intakter Kern bricht Licht beim Einstellen des Fokus und macht auch die ungefähre Mitte der Zelle dunkler im Aussehen. Der Kern wird auch die GFP:CID “Punkte” enthalten, ein weiteres Unterscheidungsmerkmal, das bei der Identifizierung hilft. Zellen mit >2 Zentrosomen, Tubulinpunkta ohne Tubulinfasern, die von ihnen austreten, oder Zellen mit nur einem Zentromom sollten vermieden werden. Wenn zwei Zentrosomen sichtbar sind, ein Kern jedoch nicht, ist NEBD bereits aufgetreten und die Zelle ist in ihrer Division zu weit fortgeschritten, um abgebildet zu werden, wenn eine vollständige M-Phasen-Analyse gewünscht wird. Sobald eine geeignete Zelle gefunden wurde, ist die Geschwindigkeit beim Starten der Bildgebung entscheidend, da NEBD schnell auftritt (in der Regel innerhalb von 3-5 min) und die Verzögerung des Beginns der Bildgebung zu verpassten Gelegenheiten führen kann. Fokussieren Sie die Zelle in der Bildgebungssoftware schnell so, dass beide Zentrosomen sichtbar sind, oder wenn Zentrosomen a-ebenerweise miteinander liegen, stellen Sie den Brennpunkt zwischen den beiden ein, so dass jeder erfasst werden kann, wenn Z-Stacks über und unter dem definierten Zentrum gesammelt werden spitze. Sobald sie fokussiert sind, stellen Sie sofort den Offset zwischen der Bühne und der Live-Zellkammeroberfläche mithilfe der Infrarotfokusprüfung (falls verfügbar) ein und starten Sie das Bildgebungsprogramm. Obwohl das hier vorgestellte Protokoll speziell auf Experimente zur Bewertung der NEBD-zu-Anaphase-Dynamik zugeschnitten ist, könnten einfache Modifikationen für Leser geeignet sein, die alternative mitotische Ereignisse untersuchen. Für die NEBD-zu-Metaphase und anaphase-to-telophase-Bildgebung schlagen wir 10 s Bildaufnahmeintervalle vor, da diese Prozesse hochdynamisch sind und schnell in S2-Zellen (5-10 min) auftreten. Metaphase-zu-Anaphase-Übergang (unser typischer experimenteller Fokus) ist ein längerer Prozess (20-30 min) in S2-Zellen, und wir sammeln Bilder in 30 s Intervallen. Schließlich tritt die Telophase-durch-Zytokinese in S2-Zellen recht langsam auf, und wir schlagen 60 s-Intervalle vor, die genügend Auflösung für diesen ungefähren einstündigen Prozess bieten.
Aufrechterhaltung des Fokus während des gesamten Imaging-Programms
Wenn ein Infrarotfokus-Prüfgerät nicht verfügbar ist, achten Sie darauf, das Mikroskop oder den Tisch, auf dem es sitzt, nicht zu stoßen, da dies dazu führen kann, dass sich die Zelle während des Bildgebungsprogramms aus dem Fokus bewegt, was zu mehrdeutigen, nicht interpretierbaren Ergebnissen führt. Die Vorbeschichtung der Live-Zellkammerbrunnen mit Poly-L-Lysin kann bei der Zellhaftung helfen, was zellweise bewegungen vermeiden kann und besonders für Setups ohne Infrarotfokusprüfungen nützlich ist. Darüber hinaus können Setups, einschließlich stoßdämpfender Plattformen oder Lufttische, dazu beitragen, dass Zellen nicht mehr aus dem Fokus geraten. Schließlich haben einige Softwareprogramme Pause-Funktionen, die es dem Benutzer ermöglichen, das Programm neu zu fokussieren und fortzusetzen.
Bildgebung mehrerer Zellen
Hilfreich für die Akkumulation von Daten ist, dass oft mehrere Zellen, die zur Teilung bereit sind, innerhalb desselben Sichtfeldes für die Bildgebung platziert werden können. Dies kann besonders nützlich sein für Experimente, bei denen Zellen eine lange M-Phasen-Dauer oder eine längere Verkleehrung haben (z. B. Bedingungen, die eine Aktivierung des SAC induzieren). Für diese Zellen bilden wir in der Regel, bis die Zellen photobleached (ca. 2-3 h), aber das volle Timing der verhafteten Zellen sollte im Ermessen des Forschers sein. Manchmal können sich die mehrfachen vorteilenden Zellen in verschiedenen Fokusebenen befinden, in diesem Fall kann es nützlich sein, Z-Stacks hinzuzufügen, um alle Zellen aufzunehmen. Das Hinzufügen weiterer z-Stacks kann auch zur Verbesserung der Auflösung beitragen. Dabei ist jedoch Vorsicht geboten, da zellenstärker erstrahlen und zu schnellerer Photobleichung führen und zu großen Dateigrößen auf Festplattenspeichern führen.
Vermeidung von Photobleichungen und Phototoxizität
Unsere Methode beschreibt spezifische Einstellungen für Belichtungszeiten, Bildgebungsintervalle, Z-Stacks und prozentuale Durchlässigkeit für unsere LED-Lichtquelle, die in der Regel für unseren experimentellen Aufbau und die gewünschten Ergebnisse funktionieren. Da Mikroskope und experimentelle Ziele variieren können, kann das, was für unser System gut funktionieren könnte, zu vorzeitiger Photobleiche oder Phototoxizität in anderen führen. Photodamage kann einen Mangel an Spindelbewegung, Mikrotubuli-Fragmentierung, defekte Mikrotubuli-Dynamik und verlängerte Spindel-Checkpoint-Aktivierung darstellen. Eine mögliche Methode, um solche Fallstricke zu vermeiden, besteht darin, die Expositionszeit zu begrenzen. Die meisten modernen Kameras verfügen heute über große Dynamikbereiche, und Histogramme können angepasst werden, um Strukturen auch bei sehr geringen Belichtungen zu visualisieren. Eine andere Technik besteht darin, das Bildgebungsintervall (z. B. auf mehrere Minuten zwischen den Bildern) so zu erhöhen, dass die Anzahl der Personen, in denen eine Zelle über ein gesamtes Erfassungsintervall dem Licht ausgesetzt wird, reduziert wird. Dies ist insbesondere bei der Bildgebung über längere Zeiträume (viele Stunden) von Vorteil und kann zusätzlich zur Verringerung der Dateigröße solcher Experimente beitragen. Die Begrenzung der Anzahl der z-Stacks kann auch dazu beitragen, die Lichtexposition zu reduzieren, indem man 2 oder sogar nur 1 anstelle von 3 verwendet. Darüber hinaus verringert die Anpassung der prozentualen Lichtdurchlässigkeit (für LED-Lichtquellen) oder die Verwendung von Neutraldichtefiltern (nd) (für Halogenlampen- und LED-Lichtquellen) die Lichtintensität und gekoppelt mit längeren Belichtungszeiten kann die Sichtbarkeit erhalten. . Durch die Auswahl von Zellen mit bereits getrennten Zentrosomen kann die Gesamtexposition eingeschränkt werden, da diese Zellen nach Beginn der Bildgebung in der Regel schnell (innerhalb von ein oder zwei Minuten) in mitoseeintreten. Sie können auch die Zeit begrenzen, die Zellen vor NEBD abgebildet werden dürfen. Unser Labor legt diese Zeit in der Regel auf 10 min fest, aber ein konservativeres Limit kann leicht vom Benutzer auferlegt werden. Darüber hinaus empfehlen wir eine “invasivere” Maßnahme, die die Behandlung mit dsRNA gegen eine Komponente des SAC (wie Rod oder Mad2) abzielt. Wenn ein Arrest-Phänotyp auf unspezifische Zellschäden zurückzuführen ist (z. B. defekte Mikrotubuli-Dynamik), ist eine solche Behandlung weniger wahrscheinlich, um die Verhaftung zu unterdrücken, als eine gutgläubige Wirkung des Gens, das für das ursprüngliche Experiment von Interesse ist.
Zukünftige Richtungen
Die hier beschriebene Methode kann auf einem relativ einfachen Epifluoreszenzmikroskop eingesetzt werden, um lebende Zellteilungen schnell abzubilden und kann leicht an das besondere experimentelle Design und die Ziele eines Forschers angepasst werden. Für S2 und andere Drosophila-Zellen 9,14,15, wurden mehrere ausgezeichnete Methoden zur Kultivierung, RNAi-Knockdown-Ansätze, transiente Transfektion und Fluoreszenzmikroskopie veröffentlicht. 16 , 17. Unser Protokoll bietet ein paar Vorteile. (1) Die Verwendung einer doppelten stabilen Zelllinie (GFP:CID, mCherry:-Tubulin) markiert gleichzeitig zwei wichtige mitotische Strukturen, vermeidet den Ärger und mögliche Komplikationen der transienten Transfektion und stellt sicher, dass fast alle Zellen fluoreszierende Marker als potenzielle Kandidaten für die Bildgebung. (2) Die Anpassung an die Mitose ergänzt die veröffentlichten Protokolle zur Untersuchung der zytoskelettalen Dynamik in motilen, nicht teilenden Zellen und erstreckt sich auf die Untersuchung von mitotischen Ereignissen in Echtzeit. Während wir glauben, dass unsere eine leistungsstarke Technik ist, die das Repertoire anderer erweitert, kann es immer Verbesserungen geben. Ein besonderer Bereich der Zellteilung, den wir schwer abzubilden gefunden haben, ist die zentromische Teilung. Dies geschieht vor NEBD und es ist schwierig zu bestimmen, wann ein einzelnes Zentromer bereit ist, sich in zwei zu trennen. Die Verwendung von fluoreszierenden Zellzyklusmarkern (Cyclin A und Cyclin B) könnte helfen, dieses Problem zu lösen, geht aber auf Kosten von Kanälen, die zur Visualisierung von Zellteilungskomponenten verwendet werden könnten. Unsere beste Strategie für den Versuch, die Zentrosome-Division zu visualisieren, besteht darin, dem Bildgebungsprogramm eine Multipoint-Erfassung hinzuzufügen (verschiedene Punkte in der XY-Ebene zu bilden), aber dies kann zu großen Dateien führen und kann auch erfordern (abhängig von der Anzahl der Punkte) Das Intervall zwischen der Bildsammlung zu erhöhen, die Zeitauflösung des resultierenden Films zu verringern. Eine andere Lösung könnte die Synchronisation von Zellen in einem gewünschten Zellzyklusstadium mit Medikamenten sein, die zellzyklusregulatore zielen, gefolgt von anschließendem Auswaschen vor der Bildgebung, obwohl diese Methoden in S2-Zellen möglicherweise nicht zuverlässig sind.
Das hier vorgestellte Protokoll bildet auch eine Grundlage für zukünftige Anwendungen in der Live-Zell-Bildgebung. Mit verbesserter Bildgebungs- und Softwaretechnologie könnten wirklich hohe Durchsatzanpassungen dieses Protokolls mit höherer Kapazität möglich sein, Multikammerplatten. Solche Innovationen würden großflächige RNAi-Bildschirme, wie sie bereits in festen Präparaten erreicht wurden,12,18, in einem Live-Zell-Format beweglicher machen. Kleine Molekül-Wirkstoff-Screens könnten auch als mittels zur Identifizierung neuartiger Verbindungen gedacht werden, die auf Zellteilungsprozesse abzielen. Die Verbesserung von Fluorophoren und optischen Filtern könnte auch zur Abbildung mehrerer mitotischer Komponenten (nicht nur der beiden, die wir beschreiben) führen und die Abbildung bestimmter mitotischer Regulatoren und ihrer Wechselwirkungen mit DNA und/oder Spindel ermöglichen. Beispielsweise wäre die Generierung von Zellen mit fluoreszierenden Reportern, die nach dem DNA-Schaden oder während der Apoptose ausdrücken, nützliche Werkzeuge, um neuartige Gene zu identifizieren, die an diesen Prozessen beteiligt sind. Ähnliche Ansätze könnten verwendet werden, um die Zellzyklusdynamik mit der Expression von fluoreszierend markierten Cyclinen19zu untersuchen.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health (R01 GM108756) finanziert. Wir danken Gary Karpen (University of California, Berkeley) dafür, dass er uns großzügig einen GFP:CID S2-Zelllinienbestand zur Verfügung gestellt hat, aus dem unsere GFP:CID/mCherry:’Tubulin-Linie generiert wurde10.
Materials
| Bright-Line Hemacytometer | Sigma-Aldrich | Z359629-1EA | for cell counting |
| cellSens imaging software | Olympus | ||
| CELLSTAR Cell Culture Flask, 50ML, 25 CM2, PS, Red Filter Screw Cap, Clear, Sterile, 10PCS/BAG | Greiner Bio-One | 690175 | |
| CELLSTAR Cell Culture Multiwell Plate, 6 well, PS, Clear, TC, Lid with condensation rings, sterile, single packed | Greiner Bio-One | 657160 | |
| Centrifuge 5804 R | eppendorf | Cat. 022623508 | |
| Copper(II) sulfate pentahydrate, minimum 98% | Sigma-Aldrich | C3036-250G | |
| Corning Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | MT35015CV | |
| Effectene Transfection Reagent 1 mL | Qiagen | 301425 | for transient transfection |
| IX-83 Inverted Epifluorescent Microscope | Olympus | ||
| LabTek Chambered Slide Insert | Applied Scientific Instruments | I-3016 | |
| MEGAscript T7 Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1334 | For dsRNA production |
| MOXI Z Mini Automated Cell Counter Kit | ORFLO | MXZ001 | for cell counting |
| MS-2000 XY Flat-Top Automated Stage and Controller | Applied Scientific Instruments | ||
| Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass (no 1.5 borosilicate glass) 8-well | Thermo Fisher Scientific | 155409 | |
| Orca-Flash 4.0 LT Camera | Hammamatsu Photonics K.K. | C11440-42U | |
| pMT/V5-His A Drosophila Expression Vector | Thermo Fisher Scientific | V412020 | |
| Poly-L-Lysine | Cultrex | 3438-100-01 | |
| Purifier Logic+ Class II, Type A2 Biosafety Cabinets | Labconco | 302310000 | |
| Schneider's insect medium | Sigma-Aldrich | S0146-100ML | |
| Spectra Tub Centrifuge Tubes | VWR | 470224-998 | |
| Uner Counter BOD Incubator | Sheldon manufacturing (VWR) | 89409-346 | |
| X-CITE 120 LED | ExcelitasTechnologies | Led light source | |
| Z -Drift Compensator (ZDC) | Olympus | infrared focus check |
References
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