Uso di celle Drosophila S2 per l'imaging live della divisione cellulare
Summary
Le divisioni cellulari possono essere visualizzate in tempo reale utilizzando proteine fluorescenti e microscopia time-lapse. Utilizzando il protocollo qui presentato, gli utenti possono analizzare le dinamiche di temporizzazione della divisione cellulare, l’assemblaggio del mandrino mitotico e il congresso cromosomico e la segregazione. I difetti in questi eventi a seguito del knockdown genico mediato dall’RNA (RNAi) possono essere valutati e quantificati.
Abstract
Drosophila Le cellule S2 sono uno strumento importante nello studio della mitosi nella coltura tissutale, fornendo informazioni molecolari su questo processo cellulare fondamentale in modo rapido e ad alta produttività. Le cellule S2 si sono dimostrate suscettibili sia alle applicazioni di imaging a cellule fisse che a quella con cellule vive. In particolare, l’imaging a cellule vive può fornire informazioni preziose su come la perdita o l’abbattimento di un gene può influenzare la cinetica e la dinamica degli eventi chiave durante la divisione cellulare, tra cui l’assemblaggio del mandrino mitotico, il congresso cromosomico e la segregazione, nonché temporizzazione complessiva del ciclo cellulare. Qui utilizziamo le cellule S2 trattate stabilmente con mCherry: z-tubulina fluorescente per contrassegnare il mandrino mitotico e GFP:CENP-A (chiamato gene ‘CID’ in Drosophila) per contrassegnare il centromero per analizzare gli effetti dei geni mitotici chiave sulla tempistica di divisioni cellulari, dalla profase (in particolare a Nuclear Envelope Breakdown; NEBD) all’inizio dell’anafase. Questo protocollo di imaging consente anche la visualizzazione del microtubulo del mandrino e delle dinamiche cromosomiche in tutta la mitosi. Qui, ci proponiamo di fornire un protocollo semplice ma completo che permetterà ai lettori di adattare facilmente le celle S2 per esperimenti di imaging dal vivo. I risultati ottenuti da tali esperimenti dovrebbero ampliare la nostra comprensione dei geni coinvolti nella divisione cellulare definendo il loro ruolo in diversi eventi simultanei e dinamici. Le osservazioni fatte in questo sistema di coltura cellulare possono essere convalidate e ulteriormente studiate in vivo utilizzando l’impressionante toolkit di approcci genetici nei moscerini.
Introduction
La Divisione Cellulare è un processo critico per tutti gli organismi multicellulari, sia nel loro sviluppo che nell’omeostasi1. La Drosophila è stata a lungo utilizzata come modello per lo studio della divisione cellulare, con esperimenti in vari tipi di tessuto e condizioni genetiche che forniscono informazioni chiave sul processo. Mentre molte di queste intuizioni provengono da condizioni cellulari fisse, la divisione cellulare è una procedura dinamica con molte parti in movimento, rendendo la visualizzazione delle cellule vive integrale alla valutazione degli effetti di RNAi o di knockout genetico su numerose parti della divisione cellulare, tra cui formazione di mandrini, congresso cromosomico e segregazione, e citocinesi.
Molti protocolli sono stati sviluppati e utilizzati nel corso degli anni per visualizzare le divisioni cellulari della Drosophila in vivo. Vari gruppi hanno coltivato tecniche per l’immagine divisioni in entrambi i dischi larvali e cervelli larvali2,3,4,5,6,7,8 . Queste tecniche, sebbene utili per l’imaging in tessuti specifici, sono limitate nella produttività e spesso richiedono la generazione e il mantenimento di scorte genetiche per generare componenti fluorescenti e alterare l’espressione di geni di interesse. Le cellule S2 coltivate della Drosophila forniscono un’alternativa più elevata alla produttività per testare rapidamente gli effetti di vari geni nella divisione cellulare. Inoltre, con la capacità di trasfecare varie proteine fluorescenti, le cellule S2 possono essere rapidamente modificate per determinare gli effetti del knockdown RNAi su numerosi componenti della divisione cellulare. I geni fluorescenti di interesse possono essere osservati anche nella divisione cellulare, consentendo una caratterizzazione dinamica della loro funzione9.
Qui forniamo un protocollo dettagliato per l’imaging dal vivo delle cellule Mitotiche S2 utilizzando metodi che abbiamo recentemente descritto10. Il nostro metodo utilizza cellule trascate stabilmente con marcatori fluorescenti per microtubuli e centrimeri la cui espressione è sotto il controllo di un promotore inducibile di rame (metallothionein; pMT). Questa metodologia può essere utilizzata per immagini dinamiche del mandrino e del cromosoma in tutte le fasi della mitosi utilizzando un microscopio fluorescente relativamente semplice con un software di imaging di base. Può essere ulteriormente personalizzato per soddisfare le esigenze di ricerca individuali, con la trasfezione transitoria e l’RNAi che offre possibilità ampliate per determinare il ruolo dei geni candidati nella mitosi. A causa della relativa semplicità del protocollo, può essere utilizzato per schermi di perdita di funzione su piccola scala per identificare i geni per i quali sarebbe utile un ulteriore studio in vivo, consentendo sforzi e efficienza più mirati con i successivi manipolazione nelle mosche.
Protocol
Representative Results
Discussion
Identificazione di una cella appropriata
La chiave per l’imaging che divide le cellule S2 è prima individuare la cellula corretta. Il tempo può essere sprecato in celle di imaging che sono erroneamente ritenute pronte a dividersi, ma che non riescono a farlo in un lasso di tempo ragionevole. Devono essere identificate cellule che abbiano due centrisomi distinti e visibili e un nucleo intatto. I centrosori devono avere fibre di microtubuli che emanano da loro, dando loro un aspetto “stellato”. Un nucleo intatto rifrange la luce quando regola la messa a fuoco, e rende anche il centro approssimativo della cellula più scuro nell’aspetto. Il nucleo conterrà anche il GFP:CID “punti”, un’altra caratteristica distintiva per aiutare nella sua identificazione. Le cellule con >2 centrosomi, puncta di tubulina senza fibre di tubulina emananti da loro, o le cellule con un solo centrosome dovrebbe essere evitato. Inoltre, se due centrosoni sono visibili, ma un nucleo non lo è, NEBD si è già verificato e la cellula è troppo avanzata nella sua divisione per essere immaginata se si desidera un’analisi completa della fase M. Una volta trovata una cella appropriata, la velocità di avvio dell’imaging è fondamentale in quanto il NEBD si verifica rapidamente (in genere entro 3-5 min) e ritardare l’inizio dell’imaging può portare a opportunità perse. Concentrare rapidamente la cella nel software di imaging in modo che entrambi i centrisomi siano visibili, o se i centrisomi sono fuori piano tra loro, impostare il punto focale tra i due, in modo che ciascuno possa essere catturato quando vengono raccolti gli stack di z sopra e sotto il centro definito punto. Una volta messa a fuoco, impostare immediatamente l’offset tra lo stadio e la superficie della camera della camera della cella attiva utilizzando il controllo della messa a fuoco a infrarossi (se disponibile) e iniziare il programma di imaging. Anche se il protocollo qui presentato è specificamente su misura per gli esperimenti che valutano le dinamiche NEBD-anaphase, semplici modifiche potrebbero soddisfare i lettori che studiano eventi mitotici alternativi. Per l’imaging da NEBD a metafase e da anaphase a telofase, suggeriamo intervalli di acquisizione delle immagini di 10 s poiché questi processi sono altamente dinamici e si verificano rapidamente nelle celle S2 (5-10 min). La transizione metafase-anafase (il nostro tipico obiettivo sperimentale) è un processo più lungo (20-30 min) nelle cellule S2 e raccogliamo immagini a intervalli di 30 s. Infine, la telophase-through-cytocinesisi si verifica abbastanza lentamente nelle cellule S2, e suggeriamo intervalli 60 s fornendo una risoluzione sufficiente per questo processo approssimativo della durata di un’ora.
Mantenere la messa a fuoco durante tutto il programma di imaging
Se non è disponibile un dispositivo di controllo della messa a fuoco a infrarossi, assicurarsi di evitare di urtare il microscopio o la tabella su cui si trova, in quanto ciò può causare lo spostamento della cella fuori fuoco durante il programma di imaging, portando a risultati ambigui e non interpretabili. Pre-rivestimento dei pozzi camera cellulare dal vivo con Poly-L-lysina può aiutare nell’aderenza cellulare, che può aiutare a evitare il movimento cellulare ed è particolarmente utile per le configurazioni senza controlli di messa a fuoco infrarossi. Inoltre, le configurazioni, tra cui piattaforme antiurto o tavoli d’aria, possono ulteriormente aiutare a evitare che le cellule si muovano fuori fuoco. Infine, alcuni programmi software hanno funzioni di pausa che consentono all’utente di rifocalizzare e riprendere il programma.
Imaging di più celle
Utile per l’accumulo di dati è che spesso più celle pronte per la divisione possono essere collocate all’interno dello stesso campo visivo per l’imaging. Ciò può essere particolarmente utile per gli esperimenti in cui le cellule hanno lunghe durate di fase M o un arresto prolungato (ad esempio, condizioni che inducono l’attivazione del SAC). Per queste cellule, in genere immaginiamo fino a quando le cellule sono fotosbiancate (circa 2-3 h), ma la tempistica completa delle cellule arrestate dovrebbe essere a discrezione del ricercatore. A volte le più celle di pre-divisione possono trovarsi in piani focali diversi, nel qual caso può essere utile aggiungere z-stack per ospitare tutte le celle. L’aggiunta di più stack z può anche aiutare a migliorare la risoluzione. Attenzione dovrebbe essere presa nel fare questo, tuttavia, in quanto esporrà le cellule a più radiazioni e porterà a una fotosbiancatura più veloce, così come portare a grandi dimensioni di file su dispositivi di archiviazione del disco rigido.
Evitare il fotobleaching e la fototossicità
Il nostro metodo descrive impostazioni specifiche per i tempi di esposizione, gli intervalli di imaging, le pile z e la trasmissione percentuale per la nostra sorgente luminosa a LED che generalmente funzionano per la nostra configurazione sperimentale e i risultati desiderati. Poiché i microscopi e gli obiettivi sperimentali possono variare, ciò che potrebbe funzionare bene per il nostro sistema può portare a fotosbiancamento prematuro o fototossicità in altri. I danni fotografici possono presentare una mancanza di movimento del mandrino, la frammentazione dei microtubuli, la dinamica difettosa dei microtubuli e l’attivazione prolungata del checkpoint del mandrino. Un metodo potenziale per evitare tali insidie è quello di limitare il tempo di esposizione. La maggior parte delle telecamere moderne ora possiede ampie gamme dinamiche e gli istogrammi possono essere regolati per visualizzare le strutture anche a esposizioni molto basse. Un’altra tecnica consiste nell’aumentare l’intervallo di imaging (ad esempio, a diversi minuti tra le immagini) in modo che il numero di volte in cui una cella viene esposta alla luce in un intervallo di raccolta totale viene ridotto. Questo è vantaggioso in particolare nell’imaging per periodi di tempo più lunghi (molte ore) e può anche aiutare a ridurre le dimensioni del file di tali esperimenti. Limitare il numero di pile z prese può anche aiutare a ridurre l’esposizione alla luce, utilizzando 2 o anche solo 1 invece di 3. Inoltre, regolare la percentuale di trasmissione della luce (per le sorgenti luminose a LED) o utilizzare filtri a densità neutra (ND) (sia per la lampada Halogen che per le sorgenti luminose a LED) diminuirà l’intensità della luce e accoppiato con tempi di esposizione più lunghi può preservare la visibilità . Scegliendo cellule con centrisomi già separati, l’esposizione complessiva può essere limitata in quanto queste cellule di solito entrano nella mitosi rapidamente (entro un minuto o due) dopo l’inizio dell’imaging. Si può anche limitare il tempo che le cellule possono essere immagini prima di NEBD. Il nostro laboratorio in genere imposta questa volta a 10 min, ma un limite più conservativo può essere facilmente imposto dall’utente. Inoltre, una misura più “invasiva” che raccomandiamo è il trattamento con dsRNA mirato contro un componente del SAC (come Rod o Mad2). Se un fenotipo dell’arresto è dovuto a danni cellulari non specifici (ad esempio, dinamiche di microtubuli difettose), tale trattamento è meno probabile che sopprimere l’arresto rispetto a un effetto in buona fede del gene di interesse nell’esperimento originale.
Indicazioni future
Il metodo qui descritto può essere utilizzato in un microscopio epifluorescente relativamente semplice per creare rapidamente un’immagine delle divisioni di cellule vive e può essere facilmente adattato per adattarsi alla progettazione e agli obiettivi sperimentali specifici di un ricercatore. Sono stati pubblicati diversi metodi eccellenti per la coltura, gli approcci di abbattimento dell’RNAi, la trasfezione transitoria e la microscopia a fluorescenza per S2 e altre cellule di Drosophila 9,14,15, 16 , 17. Il nostro protocollo offre un paio di vantaggi. (1) L’uso di una doppia linea cellulare stabile (GFP:CID, mCherry:z-Tubulin) segna contemporaneamente due strutture mitotiche chiave, evita il fastidio e le potenziali complicazioni della trasparenza transitoria e assicura che quasi tutte le cellule esprimano marcatori fluorescenti come potenziali candidati per l’imaging. (2) L’adattamento alla mitosi si aggiunge ai protocolli pubblicati che esaminano le dinamiche citoscheletriche nelle cellule motili e non dividende e si estende all’esame degli eventi mitotici in tempo reale. Mentre crediamo che la nostra sia una tecnica potente che si aggiunge al repertorio degli altri, ci possono sempre essere miglioramenti fatti. Una particolare area della divisione cellulare che abbiamo trovato difficile da immaginare è la divisione centrosome. Ciò si verifica prima del NEBD ed è difficile determinare quando un singolo centrosome è pronto a separarsi in due. L’utilizzo di marcatori fluorescenti del ciclo cellulare (Cyclin A e Cyclin B) potrebbe aiutare a risolvere questo problema, ma viene a scapito dei canali che potrebbero essere utilizzati per visualizzare i componenti della divisione cellulare. La nostra migliore strategia per tentare di visualizzare la divisione centrosome è quella di aggiungere l’acquisizione multipunto al programma di imaging (definendo diversi punti nel piano XY per l’immagine), ma questo può comportare file di grandi dimensioni e può anche richiedere (a seconda del numero di punti) aumentando l’intervallo tra la raccolta di immagini, riducendo la risoluzione del tempo del filmato risultante. Un’altra soluzione potrebbe essere la sincronizzazione delle cellule in una fase del ciclo cellulare desiderato utilizzando farmaci che prendono di mira i regolatori del ciclo cellulare seguiti da un successivo lavaggio prima dell’imaging, anche se questi metodi potrebbero non essere affidabili nelle cellule S2 in modo specifico.
Il protocollo qui presentato fornisce una base per le future applicazioni anche nell’imaging delle cellule vive. Grazie a una migliore tecnologia di imaging e software, potrebbero essere possibili adattamenti di velocità effettiva veramente elevati di questo protocollo utilizzando una capacità più elevata, le piastre multicamera. Tali innovazioni renderebbero gli schermi RNAi su larga scala, come quelli già realizzati nei preparati fissi12,18, più trattabili in un formato di cella dal vivo. Anche schermi di farmaci di piccole molecole potrebbero essere concepiti come un mezzo per identificare nuovi composti mirati ai processi di divisione cellulare. Il miglioramento dei fluorofori e dei filtri ottici potrebbe anche portare all’imaging di più componenti mitotici (non solo dei due che descriviamo), consentendo l’imaging di specifici regolatori mitotici e le loro interazioni con il DNA e/o il mandrino. Ad esempio, generare cellule con reporter fluorescenti che esprimono in seguito al danno del DNA o durante l’apoptosi sarebbero strumenti utili per identificare nuovi geni coinvolti in questi processi. Approcci simili potrebbero essere utilizzati per esaminare le dinamiche del ciclo cellulare utilizzando l’espressione di cicline fluorescenti19.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato finanziato dai National Institutes of Health (R01 GM108756). Siamo grati a Gary Karpen (Università della California, Berkeley) per averci generosamente fornito un stock di linee cellulari GFP:CID S2 da cui è statageneratala nostra linea GFP:CID/mCherry:
Materials
| Bright-Line Hemacytometer | Sigma-Aldrich | Z359629-1EA | for cell counting |
| cellSens imaging software | Olympus | ||
| CELLSTAR Cell Culture Flask, 50ML, 25 CM2, PS, Red Filter Screw Cap, Clear, Sterile, 10PCS/BAG | Greiner Bio-One | 690175 | |
| CELLSTAR Cell Culture Multiwell Plate, 6 well, PS, Clear, TC, Lid with condensation rings, sterile, single packed | Greiner Bio-One | 657160 | |
| Centrifuge 5804 R | eppendorf | Cat. 022623508 | |
| Copper(II) sulfate pentahydrate, minimum 98% | Sigma-Aldrich | C3036-250G | |
| Corning Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | MT35015CV | |
| Effectene Transfection Reagent 1 mL | Qiagen | 301425 | for transient transfection |
| IX-83 Inverted Epifluorescent Microscope | Olympus | ||
| LabTek Chambered Slide Insert | Applied Scientific Instruments | I-3016 | |
| MEGAscript T7 Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1334 | For dsRNA production |
| MOXI Z Mini Automated Cell Counter Kit | ORFLO | MXZ001 | for cell counting |
| MS-2000 XY Flat-Top Automated Stage and Controller | Applied Scientific Instruments | ||
| Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass (no 1.5 borosilicate glass) 8-well | Thermo Fisher Scientific | 155409 | |
| Orca-Flash 4.0 LT Camera | Hammamatsu Photonics K.K. | C11440-42U | |
| pMT/V5-His A Drosophila Expression Vector | Thermo Fisher Scientific | V412020 | |
| Poly-L-Lysine | Cultrex | 3438-100-01 | |
| Purifier Logic+ Class II, Type A2 Biosafety Cabinets | Labconco | 302310000 | |
| Schneider's insect medium | Sigma-Aldrich | S0146-100ML | |
| Spectra Tub Centrifuge Tubes | VWR | 470224-998 | |
| Uner Counter BOD Incubator | Sheldon manufacturing (VWR) | 89409-346 | |
| X-CITE 120 LED | ExcelitasTechnologies | Led light source | |
| Z -Drift Compensator (ZDC) | Olympus | infrared focus check |
References
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