استخدام خلايا Drosophila S2 للتصوير الحي لقسم الخلايا
Summary
يمكن تصور أقسام الخلايا في الوقت الحقيقي باستخدام البروتينات ذات العلامات الفلورية والفحص المجهري الفاصل الزمني. باستخدام البروتوكول المعروض هنا، يمكن للمستخدمين تحليل ديناميات توقيت تقسيم الخلايا، وتجميع المغزل الميتومي، والكونغرس الكروموسومي والفصل. يمكن تقييم العيوب في هذه الأحداث بعد تدخل الحمض النووي الريبي (RNAi) بوساطة الجينات بالضربة القاضية وتحديدها كمياً.
Abstract
دروسوفيلا خلايا S2 هي أداة هامة في دراسة ميتوسيفيفي تثقافة الأنسجة، وتوفير رؤى جزيئية في هذه العملية الخلوية الأساسية بطريقة سريعة وعالية الإنتاجية. وقد ثبت أن الخلايا S2 قابلة للتطبيقات التصوير الثابتة والخلايا الحية على حد سواء. وتجدر الإشارة إلى أن التصوير بالخلايا الحية يمكن أن ينتج معلومات قيمة حول كيفية تأثير فقدان الجين أو ضربه على حركية وديناميات الأحداث الرئيسية أثناء انقسام الخلايا، بما في ذلك تجميع المغزل الميتومي، والكونغرس الكروموسومي، والفصل، وكذلك توقيت دورة الخلية عموما. هنا نستخدم S2 الخلايا transfected بشكل لا يطاق مع الفلورسنت الموسومة mCherry:α-tubulin للاحتفال المغزل الميتيوتيك وGFP:CENP-A (يشار إليها باسم ‘CID’ الجينات في دروسوفيلا)للاحتفال سنترومير لتحليل آثار الجينات المنوطية الرئيسية على توقيت تقسيمالخلايا، من المرحلة التمهيدية (على وجه التحديد في انهيار المغلف النووي؛ NEBD) إلى بداية الطور. يسمح بروتوكول التصوير هذا أيضًا بتصور الأنابيب الدقيقة المغزل وديناميات الكروموسوم في جميع أنحاء الميكروتواسي. هنا، ونحن نهدف إلى توفير بروتوكول بسيط ولكن شامل من شأنها أن تسمح للقراء بسهولة تكييف خلايا S2 لتجارب التصوير الحي. وينبغي أن تؤدي النتائج التي يتم الحصول عليها من هذه التجارب إلى توسيع فهمنا للجينات المشاركة في انقسام الخلايا من خلال تحديد دورها في العديد من الأحداث المتزامنة والدينامية. ويمكن التحقق من صحة الملاحظات التي أبديت في هذا النظام لثقافة الخلايا ومواصلة التحقيق فيها في الجسم الحي باستخدام مجموعة أدوات مثيرة للإعجاب من النهج الوراثية في الذباب.
Introduction
قسم الخلايا هي عملية حاسمة لجميع الكائنات متعددة الخلايا، سواء في تطورها والتوازن1. وقد استخدمت Drosophila منذ فترة طويلة كنموذج لدراسة انقسام الخلايا، مع تجارب في أنواع الأنسجة المختلفة والظروف الوراثية توفير رؤى رئيسية في هذه العملية. في حين أن العديد من هذه الرؤى تأتي من ظروف الخلايا الثابتة، تقسيم الخلايا هو إجراء ديناميكي مع العديد من الأجزاء المتحركة، مما يجعل التصور من الخلايا الحية جزءا لا يتجزأ من تقييم RNAi أو الآثار الوراثية بالضربة القاضية على أجزاء عديدة من انقسام الخلايا، بما في ذلك تشكيل المغزل، كروموسوم الكونغرس والفصل، والسيتوكينيسيس.
وقد وضعت العديد من البروتوكولات واستخدامها على مر السنين لتصور أقسام الخلايا Drosophila في الجسم الحي. وقد زرعت مجموعات مختلفة تقنيات لأقسام الصورة في كل من الأقراصالتخيلية اليرقات وأدمغة اليرقات 2،3،4،5،6،7،8 . هذه التقنيات، على الرغم من أنها مفيدة للتصوير في أنسجة محددة، محدودة في الإنتاجية وتتطلب في كثير من الأحيان توليد وصيانة المخزونات الوراثية لتوليد مكونات الفلورسنت وتغيير التعبير عن الجينات ذات الأهمية. توفر الخلايا المستزرعة S2 من Drosophila بديلاً أعلى للسرعة من الإنتاجية لاختبار آثار الجينات المختلفة في انقسام الخلايا. وعلاوة على ذلك، مع القدرة على نقل مختلف البروتينات الفلورية، يمكن تعديل خلايا S2 بسرعة لتحديد آثار ضربة قاضية RNAi على العديد من مكونات انقسام الخلايا. ويمكن أيضا أن يلاحظ الجينات ذات العلامات الفلورية ذات الأهمية في انقسام الخلايا، مما يسمح بالتوصيف الديناميكي لوظيفتها9.
هنا نقدم بروتوكول مفصل للتصوير الحي لخلايا S2 mitotic باستخدام أساليب وصفنا مؤخرا10. تستخدم طريقتنا الخلايا المتحولة بشكل لا يُطلَك مع علامات الفلورسنت للأنابيب الدقيقة والسنتروميرالتي يكون تعبيرها تحت السيطرة على محرك بروموتور اتنك (ميتالوثيونين؛ pMT). ويمكن استخدام هذه المنهجية لصورة المغزل وديناميات الكروموسوم في جميع مراحل الميثوسية باستخدام مجهر فلورسنت بسيط نسبيا مع برامج التصوير الأساسية. ويمكن تخصيص هاد ليلائم الاحتياجات البحثية الفردية، مع الانحراف العابر وRNAi التي توفر إمكانيات موسعة لتحديد دور الجينات المرشحة في الكيتوسية. وبسبب البساطة النسبية للبروتوكول، يمكن استخدامه لشاشات فقدان الوظائف على نطاق صغير لتحديد الجينات التي سيكون من المفيد إجراء مزيد من الدراسة لها في الجسم الحي، مما يسمح ببذل جهود أكثر تركيزاوكفاءة مع العوامل الوراثية اللاحقة. التلاعب في الذباب.
Protocol
Representative Results
Discussion
تحديد خلية مناسبة
مفتاح التصوير تقسيم الخلايا S2 هو أولا تحديد موقع الخلية المناسبة. يمكن إضاعة الوقت خلايا التصوير التي يعتقد خطأ أن تكون على استعداد لتقسيم ولكن تفشل في القيام بذلك في إطار زمني معقول. يجب تحديد الخلايا التي تحتوي على اثنين من centrosomes متميزة ومرئية ونواة سليمة. يجب أن يكون Centrosomes ألياف microtubule المنبثقة منها، مما يعطيها مظهر “مثل النجوم”. نواة سليمة ينكسر الضوء عند ضبط التركيز، ويجعل أيضا المركز التقريبي للخلية أغمق في المظهر. وستحتوي النواة أيضا على “نقاط” GFP:CID، وهي سمة مميزة أخرى للمساعدة في تحديدها. الخلايا مع > 2 centrosomes، التثواب tubulin دون ألياف توبولين المنبثقة منها، أو الخلايا مع سنتروسوم واحد فقط ينبغي تجنبها. بالإضافة إلى ذلك، إذا كان اثنين من centrosomes مرئية، ولكن نواة ليست كذلك، وقد حدث بالفعل NEBD والخلية متقدمة جدا في تقسيمها ليتم تصويرها إذا كان من المرغوب فيه تحليل مرحلة M كاملة. بمجرد العثور على خلية مناسبة، فإن السرعة في بدء التصوير أمر بالغ الأهمية حيث يحدث NEBD بسرعة (عادة في غضون 3-5 دقائق) وتأخير بدء التصوير يمكن أن يؤدي إلى فرص ضائعة. تركيز الخلية في برنامج التصوير بسرعة بحيث يكون كل من centrosomes مرئية، أو إذا سنتروسومس هي خارج المستوى مع بعضها البعض، تعيين نقطة الاتصال بين الاثنين، بحيث يمكن التقاط كل منها عندما يتم جمع أكوام Z فوق وتحت المركز المحدد نقطه. مرة واحدة تركز، على الفور تعيين الإزاحة بين المرحلة وسطح غرفة الخلية الحية باستخدام فحص التركيز بالأشعة تحت الحمراء (إذا كان متوفرا) والبدء في برنامج التصوير. على الرغم من أن البروتوكول المعروض هنا مصمم خصيصًا للتجارب التي تقيّم ديناميات NEBD-to-anaphase، إلا أن التعديلات البسيطة يمكن أن تناسب القراء الذين يدرسون الأحداث الميتومية البديلة. بالنسبة للتصوير من NEBD إلى metaphase والتصوير من اللافية إلى التيلوفاسي، نقترح 10 فترات لالتقاط الصور لأن هذه العمليات ديناميكية للغاية وتحدث بسرعة في خلايا S2 (5-10 دقائق). الانتقال من المرحلة إلى الطور (تركيزنا التجريبي النموذجي) هو عملية أطول (20-30 دقيقة) في خلايا S2، ونحن نجمع الصور على فترات 30 s. وأخيرا، يحدث التإلى مرحلة من خلال السيتوكينيس ببطء شديد في خلايا S2، ونقترح 60 ق فترات توفير ما يكفي من القرار لهذه العملية التقريبية لمدة ساعة.
الحفاظ على التركيز في جميع أنحاء برنامج التصوير
إذا لم يكن جهاز فحص التركيز بالأشعة تحت الحمراء متوفرًا، فتأكد من تجنب صدم المجهر أو الجدول الذي يجلس عليه، حيث يمكن أن يؤدي ذلك إلى انتقال الخلية من التركيز أثناء برنامج التصوير، مما يؤدي إلى نتائج غامضة وغير قابلة للتفسير. قبل طلاء آبار غرفة الخلية الحية مع بولي-L-يسين يمكن أن تساعد في الالتزام الخلية، والتي يمكن أن تساعد على تجنب حركة الخلية ومفيدة بشكل خاص للإعدادات دون الشيكات التركيز بالأشعة تحت الحمراء. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تساعد الإعدادات بما في ذلك منصات امتصاص الصدمات أو طاولات الهواء في تجنب انتقال الخلايا خارج نطاق التركيز البؤري. وأخيراً، تحتوي بعض البرامج على وظائف إيقاف مؤقت تسمح للمستخدم بإعادة تركيز البرنامج واستئنافه.
تصوير خلايا متعددة
يساعد على تراكم البيانات هو أنه في كثير من الأحيان يمكن وضع خلايا متعددة جاهزة للتقسيم داخل نفس مجال العرض للتصوير. ويمكن أن يكون ذلك مفيداً بشكل خاص للتجارب التي تكون فيها للخلايا فترات طويلة في المرحلة M أو اعتقال مطول (مثل الظروف التي تحفز على تنشيط SAC). بالنسبة لهذه الخلايا، ونحن عادة صورة حتى يتم تبييض الخلايا (حوالي 2-3 ح)، ولكن التوقيت الكامل للخلايا القبض يجب أن يكون وفقا لتقدير الباحث. في بعض الأحيان يمكن أن تكون الخلايا متعددة قبل تقسيم في مستويات محورية مختلفة، وفي هذه الحالة قد يكون من المفيد إضافة مكدسات z لاستيعاب جميع الخلايا. إضافة المزيد من مكدسات z يمكن أن تساعد أيضا في تحسين الدقة. ومع ذلك، ينبغي توخي الحذر عند القيام بذلك، حيث أنه سيعرض الخلايا لمزيد من الإشعاع ويؤدي إلى تبييض ضوئي أسرع، فضلا ً عن أنه يؤدي إلى أحجام ملفات كبيرة على أجهزة تخزين الأقراص الثابتة.
تجنب تبييض الصور والسمية الضوئية
تصف طريقتنا إعدادات محددة لأوقات التعرض، وفواصل التصوير، ومكدسات z، ونفاذية النسبة المئوية لمصدر ضوء LED لدينا الذي يعمل بشكل عام لإعدادنا التجريبي والنتائج المطلوبة. كما المجاهر والأهداف التجريبية قد تختلف، ما قد يعمل بشكل جيد لنظامنا قد يؤدي إلى تبييض الصور قبل الأوان أو السمية الضوئية في الآخرين. قد يقدم الضرر الضوئي عدم وجود حركة المغزل، وتفتت الأنابيب الدقيقة، وديناميات الأنابيب الدقيقة المعيبة، وتفعيل نقطة تفتيش المغزل لفترات طويلة. وتتمثل إحدى الطرق المحتملة لتجنب هذه المزالق في الحد من وقت التعرض. معظم الكاميرات الحديثة تمتلك الآن نطاقات ديناميكية واسعة، ويمكن تعديل الرسوم البيانية لتصور الهياكل حتى في التعرض منخفضة جدا. وثمة تقنية أخرى تتهيى بزيادة الفاصل الزمني للتصوير (على سبيل المثال، إلى عدة دقائق بين الصور) بحيث يتم تقليل عدد المرات التي تتعرض فيها الخلية للضوء على مدى فترة جمع إجمالية. وهذا مفيد بشكل خاص في التصوير لفترات زمنية أطول (ساعات عديدة)، ويمكن أن يساعد بالإضافة إلى ذلك في تقليل حجم ملف هذه التجارب. الحد من عدد مكدسات z التي اتخذت يمكن أن تساعد أيضا في الحد من التعرض للضوء، وذلك باستخدام 2 أو حتى 1 فقط بدلا من 3. وعلاوة على ذلك، فإن ضبط نسبة انتقال الضوء (لمصادر ضوء LED)، أو استخدام مرشحات الكثافة المحايدة (ND) (لكل من مصباح الهالوجين ومصادر ضوء LED) سوف يقلل من شدة الضوء ويقترن بأوقات تعرض أطول يمكن أن يحافظ على الرؤية . عن طريق اختيار الخلايا مع سنتروسوميس منفصلة بالفعل، يمكن أن يكون التعرض العام محدودة في أن هذه الخلايا عادة ما تدخل mitosis بسرعة (في غضون دقيقة أو اثنتين) بعد بدء التصوير. يمكن للمرء أيضا تحديد الوقت الذي يسمح للخلايا ليتم تصويرها قبل NEBD. عادة ما يحدد مختبرنا هذه المرة في 10 دقيقة، ولكن يمكن فرض حد أكثر تحفظا بسهولة من قبل المستخدم. بالإضافة إلى ذلك، فإن إجراء أكثر ‘الغازية’ نوصي هو العلاج مع dsRNA المستهدفة ضد عنصر من SAC (مثل رود أو Mad2). إذا كان النمط الظاهري للاعتقال يرجع إلى تلف خلية غير محددة (على سبيل المثال، ديناميات microtubule المعيبة)، فإن مثل هذا العلاج أقل عرضة لقمع الاعتقال مقارنة بتأثير حسن النية لجين الاهتمام في التجربة الأصلية.
الاتجاهات المستقبلية
الطريقة الموصوفة هنا يمكن استخدامها على مجهر الفلورسنت بسيطة نسبيا لصورة بسرعة الانقسامات الخلية الحية ويمكن تكييفها بسهولة لتناسب التصميم التجريبي الخاص للباحث والأهداف. وقد نشرت عدة طرق ممتازة للزراعة، RNAi طرق الضربة القاضية، وtransmicroction عابرة، والمجهرية الفلورية لS2 وغيرها من خلايا دروسوفيلا 9،14،15، 16 سنة , 17.بروتوكولنا يقدم اثنين من المزايا. (1) استخدام خط خلية مستقرة مزدوجة (GFP: CID، mCherry:α-Tubulin) في وقت واحد علامات اثنين من الهياكل المصوية الرئيسية، ويتجنب المتاعب والمضاعفات المحتملة للانعاص العابر، ويضمن أن جميع الخلايا تقريبا سوف تعبر عن علامات الفلورسنت كما المرشحين المحتملين للتصوير. (2) يضيف التكيف مع الانقسام إلى البروتوكولات المنشورة التي تفحص الديناميات السيتوووووغفية في الخلايا غير المنقسمة، ويمتد إلى دراسة الأحداث السيتوتيكية في الوقت الحقيقي. في حين أننا نعتقد أن أسلوبنا هو تقنية قوية تضيف إلى ذخيرة الآخرين، يمكن أن يكون هناك دائما تحسينات. مجال معين من تقسيم الخلايا التي وجدنا من الصعب تصويرها هو تقسيم المركزية. يحدث هذا قبل NEBD ومن الصعب تحديد متى يكون centrosome واحد على استعداد للفصل إلى اثنين. استخدام علامات دورة الخلية الفلورية (Cyclin A و Cyclin B) يمكن أن تساعد في حل هذه المشكلة، ولكن يأتي على حساب القنوات التي يمكن استخدامها لتصور مكونات تقسيم الخلية. أفضل استراتيجية لدينا لمحاولة تصور تقسيم سنتروسوم هو إضافة اكتساب عدة نقاط إلى برنامج التصوير (تحديد نقاط مختلفة في مستوى XY إلى صورة)، ولكن هذا يمكن أن يؤدي إلى ملفات كبيرة، ويمكن أن تتطلب أيضا (اعتمادا على عدد من النقاط) زيادة الفاصل الزمني بين جمع الصور، وتقليل دقة الوقت للفيلم الناتج. ويمكن أن يكون حل آخر تزامن الخلايا في مرحلة دورة الخلية المطلوبة باستخدام الأدوية التي تستهدف المنظمين دورة الخلية تليها غسل اللاحقة قبل التصوير, على الرغم من أن هذه الأساليب قد لا تكون موثوقة في الخلايا S2 على وجه التحديد.
ويوفر البروتوكول المعروض هنا أساسا للتطبيقات المستقبلية في التصوير بالخلايا الحية أيضا. ومع تحسين تكنولوجيا التصوير والبرمجيات، يمكن أن يكون من الممكن إجراء تعديلات عالية حقاً على إنتاجية هذا البروتوكول باستخدام قدرة أعلى، يمكن أن تكون اللوحات متعددة الغرف ممكنة. مثل هذه الابتكارات من شأنها أن تجعل شاشات RNAi على نطاق واسع، مثل تلك التي تحققت بالفعل في الاستعدادات الثابتة12،18،أكثر قابلية للبسط في شكل خلية حية. ويمكن أيضا تصور شاشات المخدرات جزيء صغير كوسيلة لتحديد المركبات الجديدة التي تستهدف عمليات تقسيم الخلايا. كما يمكن أن يؤدي تحسين الفلوروفوروالات البصرية إلى تصوير مكونات ميتوتيك متعددة (وليس فقط المكونات التي نصفها)، مما يتيح تصوير جهات تنظيمية ميتوتيكية محددة وتفاعلاتها مع الحمض النووي و/أو المغزل. على سبيل المثال، توليد الخلايا مع الصحفيين الفلورسنت التي تعبر عن بعد تلف الحمض النووي أو أثناء المبرمج سيكون أدوات مفيدة لتحديد الجينات الجديدة المشاركة في هذه العمليات. ويمكن استخدام نُهج مماثلة لدراسة ديناميات دورة الخلايا باستخدام تعبير السيكلينات ذات العلامات الفلورية19.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (R01 GM108756). نحن ممتنون لغاري كاربن (جامعة كاليفورنيا، بيركلي) لتزويدنا بسخاء مع GFP: CID S2 مخزون خط الخلية التي لدينا GFP: CID / mCherry: تم إنشاء خط αTubulin10.
Materials
| Bright-Line Hemacytometer | Sigma-Aldrich | Z359629-1EA | for cell counting |
| cellSens imaging software | Olympus | ||
| CELLSTAR Cell Culture Flask, 50ML, 25 CM2, PS, Red Filter Screw Cap, Clear, Sterile, 10PCS/BAG | Greiner Bio-One | 690175 | |
| CELLSTAR Cell Culture Multiwell Plate, 6 well, PS, Clear, TC, Lid with condensation rings, sterile, single packed | Greiner Bio-One | 657160 | |
| Centrifuge 5804 R | eppendorf | Cat. 022623508 | |
| Copper(II) sulfate pentahydrate, minimum 98% | Sigma-Aldrich | C3036-250G | |
| Corning Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | MT35015CV | |
| Effectene Transfection Reagent 1 mL | Qiagen | 301425 | for transient transfection |
| IX-83 Inverted Epifluorescent Microscope | Olympus | ||
| LabTek Chambered Slide Insert | Applied Scientific Instruments | I-3016 | |
| MEGAscript T7 Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1334 | For dsRNA production |
| MOXI Z Mini Automated Cell Counter Kit | ORFLO | MXZ001 | for cell counting |
| MS-2000 XY Flat-Top Automated Stage and Controller | Applied Scientific Instruments | ||
| Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass (no 1.5 borosilicate glass) 8-well | Thermo Fisher Scientific | 155409 | |
| Orca-Flash 4.0 LT Camera | Hammamatsu Photonics K.K. | C11440-42U | |
| pMT/V5-His A Drosophila Expression Vector | Thermo Fisher Scientific | V412020 | |
| Poly-L-Lysine | Cultrex | 3438-100-01 | |
| Purifier Logic+ Class II, Type A2 Biosafety Cabinets | Labconco | 302310000 | |
| Schneider's insect medium | Sigma-Aldrich | S0146-100ML | |
| Spectra Tub Centrifuge Tubes | VWR | 470224-998 | |
| Uner Counter BOD Incubator | Sheldon manufacturing (VWR) | 89409-346 | |
| X-CITE 120 LED | ExcelitasTechnologies | Led light source | |
| Z -Drift Compensator (ZDC) | Olympus | infrared focus check |
References
- Ragkousi, K., Gibson, M. C. Cell division and the maintenance of epithelial order. Journal of Cell Biology. 207 (2), 181-188 (2014).
- Aldaz, S., Escudero, L. M., Freeman, M. Live imaging of Drosophila imaginal disc development. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 107 (32), 14217-14222 (2010).
- Cabernard, C., Doe, C. Q. Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila. Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (10), 970-977 (2013).
- Lerit, D. A., Plevock, K. M., Rusan, N. M. Live imaging of Drosophila larval neuroblasts. Journal of Visualized Experiments. (89), (2014).
- Morris, L. X., Spradling, A. C. Long-term live imaging provides new insight into stem cell regulation and germline-soma coordination in the Drosophila ovary. Development. 138 (11), 2207-2215 (2011).
- Prasad, M., Jang, A. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. A protocol for culturing Drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging. Nature Protocols. 2 (10), 2467-2473 (2007).
- Restrepo, S., Zartman, J. J., Basler, K. Cultivation and Live Imaging of Drosophila Imaginal Discs. Methods in Molecular Biology. 1478, 203-213 (2016).
- Tsao, C. K., Ku, H. Y., Lee, Y. M., Huang, Y. F., Sun, Y. H. Long Term Ex Vivo Culture and Live Imaging of Drosophila Larval Imaginal Discs. PLoS One. 11 (9), e0163744 (2016).
- Rogers, S. L., Rogers, G. C. Culture of Drosophila S2 cells and their use for RNAi-mediated loss-of-function studies and immunofluorescence microscopy. Nature Protocols. 3 (4), 606-611 (2008).
- Dewey, E. B., Johnston, C. A. Diverse mitotic functions of the cytoskeletal cross-linking protein Shortstop suggest a role in Dynein/Dynactin activity. Molecular Biology of the Cell. 28 (19), 2555-2568 (2017).
- Rodriguez, E. A., et al. The Growing and Glowing Toolbox of Fluorescent and Photoactive Proteins. Trends in Biochemical Sciences. 42 (2), 111-129 (2017).
- Kwon, M., et al. Mechanisms to suppress multipolar divisions in cancer cells with extra centrosomes. Genes and Development. 22 (16), 2189-2203 (2008).
- Basto, R., Gomes, R., Karess, R. E. Rough deal and Zw10 are required for the metaphase checkpoint in Drosophila. Nature Cell Biology. 2 (12), 939-943 (2000).
- Currie, J. D., Rogers, S. L. Using the Drosophila melanogaster D17-c3 cell culture system to study cell motility. Nature Protocols. 6 (10), 1632-1641 (2011).
- Lu, W., Del Castillo, U., Gelfand, I. V. Organelle transport in cultured Drosophila cells: S2 cell line and primary neurons. Journal of Visualized Experiments. (81), e50838 (2013).
- Yang, J., Reth, M. Drosophila S2 Schneider cells: a useful tool for rebuilding and redesigning approaches in synthetic biology. Methods in Molecular Biology. 813, 331-341 (2012).
- Zhou, R., Mohr, S., Hannon, G. J., Perrimon, N. Inducing RNAi in Drosophila cells by soaking with dsRNA. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (5), (2014).
- Goshima, G., et al. Genes required for mitotic spindle assembly in Drosophila S2 cells. Science. 316 (5823), 417-421 (2007).
- Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132 (3), 487-498 (2008).
