שימוש ב- Drosophila ילה S2 תאים עבור הדמיה חיה של חטיבת התא

1. הכנת תאים S2 לטיפול עם RNAi מתוך תרבות של מניות של confluent pMT: GFP: CID ו-pMT: mCherry: α-טובולין באופן שוטף תאים S2 (~ 80% קיימא; גדל ב 24-28 ° c), תאים זרע ב 6 היטב הלוח התרבות סטרילי בצפיפות של 1 x 106 תאים/mL ב טרי, מחומם, 10% סרום שור עוברי באמצעות מדיית החרקים (SIM) של שניידר.הערה: ניתן להפיק תאים S2 בלתי מוכרים על-ידי ביצוע פרוטוקול ממרכז הסינון דרוסופילה RNAI (drsc) (https://dgrc.bio.indiana.edu/Protocols?tab=cells). למרות קו S2 מסוים יציבה משמש במקום זה מנצל GFP ו-mCherry, חלופות רבות קיימות הן בתוך ספקטרום פלורסנט, כמו גם אחרים. דיון מפורט של חלבונים אלה הוא מעבר להיקף של פרוטוקול זה, אבל המאפיינים שלהם ויתרונות פוטנציאליים/חסרונות שנבדקו במומחיות במקומות אחרים 11. באמצעות מונה תאים או הומוציטומטר, יש לקבוע את צפיפות מלאי התאים הקונשוטפת. לקבוע את נפח ההשעיה של התא confluent הדרוש כדי להשיג 1 x 106 תאים/mL בנפח כולל של 4 מ ל (למשל, ~ 4 x 106 הכולל תאים). הוסף נפח זה של מלאי תאים לנפח של SIM טרי כדי להפוך את הנפח 4 מ ל/כל הטוב. לקבוע את צפיפות מלאי התא (תאים/mL) על ידי דילול 100 μL של תאים ישירות מתוך בקבוקון המניות עם 100 μL של מדיה ולספור את זה 1:2 דילול באופן ידני עם היפוך או עם מונה תאים אוטומטי אם זמין.הערה: אם השימוש בתאים S2 לא באופן מספק, שיטת החצייה חולף עם מתויג פלואורוסקופים (GFP, mCherry, וכו ‘) α-או β-טובולין, ו סמן DNA (CENP-A, Histone H2B, וכו ‘) ניתן לבצע. יתר על כן, קווים ניידים באופן מבוקר עם ציר mitotic שונים סמנים DNA זמינים ממרכז המשאבים הגנטיקה Drosophila ילה שעשוי להתאים את הצרכים הניסיוניים המדויקים של המשתמש (https://dgrc.bio.indiana.edu/cells/Catalog). מניחים תאים טריים הנזרע לתוך 24-28 מעלות צלזיוס בחממה עבור 36-48 h. 2. טיפול בתאים מזרע עם dsRNA נגד גנים (s) של עניין הערה: הדוגמה הבאה ומקטע התוצאות ישתמשו בבלם (Shot), סוכן המקשר בין המיקרו-כדורית, כגן העניין. השתמש בטיפול מבוים ללא dsRNA או עם dsRNA בבימויו של גן לא רלוונטי (למשל, ביתא-גלטוסיידאז, lacz) כשליטה שלילית. מדיית החרקים החמה של שניידר לא התבצעה עם FBS (מדיה חופשית בסרום; SFM) בחממה 24-28 ° c. העבר תאים מתוך שנזרע בעבר (משלב 1.1.2) לתוך שפופרת סטרילי 15 mL, וציין את הנפח הכולל של תאים שהועברו. שמירה על נפח קטן של תאים (~ 100 μL) לספירה במונה תאים או בהמעי. בעדינות גלולה התאים על ידי תפרידו ב 1,000 x g עבור 3 דקות בטמפרטורת החדר. בעוד תפרידו תאים, לקבוע את הריכוז של תאים לכל mL באמצעות מונה תא או הומוציטומטר. הכפל מספר זה לפי אמצעי האחסון הכולל שcentrifuged (שצוין ב-1.2.2.) כדי לקבל את המספר הכולל של תאים. . מתוך התאים הפלגנים השהה מחדש את התאים ב-SFM החומם כדי לקבל ריכוז של 3x 10 תאים /mL. העבר 1 מ ל של תאים מושעה לבאר חדשה בצלחת 6 היטב. הוסף 10-50 μg של dsRNA (מדולל ב 100 μL of RNAase-מים ללא תשלום) נגד Shot (או גן היעד של עניין) ישירות לתאים ומערבולת את הצלחת לערבב. מודקת את הצלחת עבור 1 h בחממה 24-28 ° c כדי לאפשר ספיגת dsRNA ישירה לתאים. במהלך הדגירה 1 h, חם 10% FBS שנוספו SIM בחממה 24-28 ° c. לאחר שהדגירה של תאים עם dsRNA עבור 1 h, להוסיף 2 מ”ל של 10% FBS שיושלם SIM ישירות לבאר בלי להסיר את 1 mL של מדיה. מניחים תאים לתוך החממה 24-28 ° c במשך 3-7 ימים.הערה: כמו עם ריכוז dsRNA, זמן הטיפול הכולל עשוי להיות ממוטב עבור הגן היעד הרצוי. כדי להעריך את היעילות RNAi, לבצע כתם מערבי על כל ליטים התא באמצעות נוגדן נגד הגן היעד. אם רצף היעד dsRNA ההתחלתי מוכיח ביעילות, עיצוב Dsrna חלופי המיועד לרצפים ייחודיים בתוך הגן היעד. 3. אינדוקציה של חלבון פלורסנט ביטוי והכנת תאים להדמיה אם תאים מזוהמים באופן ממושך נוצרו באמצעות הפלפמיד pMT (המכיל inducible מטת’מיםםמיםםמיםםמיםםמיםםמיםםמיםםמיםםםםםםםםםםםםםםםםםםםםםםםםםםםםם 500 μM עבור 24-36 h לפני הדמיה ו 4 ימים לאחר הטיפול RNAi. שימוש בבחינה חוקתית כגון ברית אינו דורש אינדוקציה נחושת. הכן תאים להדמיה חמם את 10% FBS שיושלם SIM בחממה 24-28 ° c עבור 1 h. העבר תאים לתוך שפופרת סטרילי 15 מ”ל, וציין את הנפח הכולל של תאים שהועברו. שמירה על נפח קטן של תאים (~ 100 μL) לספירה במונה תאים או בהמעי. בעדינות גלולה התאים על ידי תפרידו ב 1,000 x g עבור 3 דקות בטמפרטורת החדר. בעוד תפרידו תאים, לקבוע את הריכוז (תאים/mL) באמצעות מונה תא או הומוציטוטומטר. הכפל מספר זה לפי אמצעי האחסון הכולל שcentrifuged (שצוין ב-2.2.2.) כדי לקבל את המספר הכולל של תאים. . מתוך התאים הפלגנים להשעות מחדש את התאים טריים, מחומם 10% FBS בתוספת SIM כדי לקבל ריכוז של 2 x 106 תאים/mL. הוסף כמות מתאימה של CuSO4 כדי לשמור על ריכוז 500 μm. העברת 200-500 μL של מחדש הושעה תאים אחד טוב של תא מרובת היטב התא לחיות ומקום על מיקרוסקופ פלורסנט הפוכה. אפשר לתאים להתיישב בחדר במשך 15-30 דקות לפני ניסויים בהדמיה.הערה: בארות התאים החיים יכול להיות מצופה מראש עם פולי-L-ליזין עבור הדבקות נוספת. 4. הגדרת תוכנית לדימות תאים בשידור חי הערה: הדמיית תאים חיים בניסוי זה בוצעה באמצעות מערכת הדמיה הפוכה התוכנה המשויכת שלה (למשל, Olympus IX83 עם חבילת התוכנה מידות cellSens). פרטים יהיו שונים על ידי יצרן מיקרוסקופ וחבילת תוכנה; כך מפורטים ההנחיות הכלליות והפעולות המפורטות להלן. באמצעות התוכנה המפעילה את מיקרוסקופ פלורסנט הפוכה, להכין תוכנית לדימות תא (או תאים) לאורך זמן. פתח את התוכנה על-ידי לחיצה כפולה על סמל שולחן העבודה של התוכנה. צור קובץ ניסיוני חדש על-ידי לחיצה על קובץ, ולאחר מכן קובץ ניסיוני חדש. ראשית, להוסיף לולאה הפקיעה זמן שבו תמונות יילקחו. עשה זאת על-ידי לחיצה על סמל סטופר (סמל לולאהבזמן קפיצה ) מסרגל הסמלים. הגדר את המרווח ב- s בכרטיסיה מנהל הניסוי ולאחר מכן הגדר את מספר המחזורים באותה כרטיסיה על-ידי חלוקת אורך הניסוי הכולל (ב-s) לפי מרווח הזמן. אפשר ללולאה לחזור על התקופה הרצויה של הזמן הכולל.הערה: בדרך כלל, תמונות נלקחים כל 30-60 s על פני תקופה של 3-4 h. בתוך הזמן שכבת לולאה הפקיעה, להוסיף בדיקת מיקוד אינפרא אדום כדי לשמור על המוקד של המטרה (אם זמין). לשם כך, הוסף את הצעד פיצוי Z-הסחף (ZDC) בתוך שכבת לולאה בזמן קפיצה על-ידי לחיצה על הריבוע עם סמל שני החצים (הזזת סמל XY) ובחירת פיצוי Z-דריפט מהתפריט הנפתח.הערה: המונח בדיקת מיקוד אינפרא-אדום מתייחס למערכת שבה משתמשים בפולס אינפרא-אדום כדי לשמור על מרחק קבוע בין המטרה לבין חדר השקופיות/ההדמיה. מיקרוסקופים רבים יש מערכת כזו, כל אחד עם מינוח קנייני משלהם. על הקוראים להתייעץ עם מדריך התפעול או הנציג שלהם לקבלת פרטים ספציפיים למתן שמות. לאחר בדיקת המיקוד אינפרא-אדום, להוסיף צעד בתוכנית לקחת תמונה רב-ערוצית (למשל, FITC עבור GFP ו TRITC עבור mCherry) על 3-5 z-ערימות על ידי הכנסת הראשון צעד מחסנית z, ולאחר מכן ציון הערוץ. בצע זאת על-ידי הוספת שכבת קבוצת רב-ערוצי בתוך שכבת הלולאה של הקפיצה בזמן על-ידי לחיצה על סמל גלגל הצבעים (סמלקבוצה רב-ערוצי ). לאחר מכן, הוסף שכבת לולאה מסוג Z של מחסנית בתוך שכבת קבוצת רב-ערוצי על-ידי לחיצה על הסמל התלת-שכבתי (סמללולאת Z-סטאק ). הגדר את גודל השלב הרצוי ואת מספר הפרוסות בכרטיסיה מנהל הניסוי והגדר את החשיפה של כל ערוץ נמוך ככל האפשר כדי למזער את הלבנת התמונות.הערה: מרווח הזמן של מחסנית z, זמן החשיפה ומדידת האחוזים עבור נוריות יכולים להשתנות. אופייני בניסויים אלה, להשתמש שלושה z-ערימות שנלקחו מעל טווח של 3 יקרומטר, מתן מרווח של 1 יקרומטר בין כל מחסנית. הגדרת מרכז התא במקום העליון והתחתון נוטה להוביל את התוצאות הטובות ביותר. התמונות נאספים לאחר מכן עבור כל ערוץ (ים) בחשיפה של 50 ms ו-% הנחה של 50% עם מסנני דחיסות נייטרלית (ND) לא מופעל. 5. תמונה מחלוקת תאים באמצעות תוכנית הדמיה של תא חי הערה: תאים S2 אינם דורשים CO2 ולצמוח בצורה אופטימלית ב 23-27 ° c. כל ההדמיה בוצעה בטמפרטורת הסביבה בחדר שבשליטת היטב. באמצעות oculars, למצוא את הפינה העליונה (או התחתון) של הבאר ולמקד את המטרה (40-60x טבילה שמן) על התאים באמצעות הערוץ mCherry (α-טובולין). סרוק לאורך החלק העליון (או התחתון) של הבאר כדי להתרחק המפריד היטב אנכי.הערה: הדמיה קרובה מדי לחוצצים היטב עלולה להפריע לבדיקות המיקוד באינפרא-אדום. מצא תא (או תאים) שנמצאים בשלהי G2 או בשלב M המוקדם (prophase).הערה: תאים אלה יכולים להיות מזוהים בצורה הטובה ביותר על ידי קיומו של בדיוק שני ‘ כוכבים כמו ‘ מבנים מיקרו (centrosomes) וגרעין שלם (המצוין על ידי אזור מעגלי של אור שהופעל בתוך התא), הן בולט בקלות באמצעות α-טובולין (אדום) מסנן עירור. בחירת תאים בשלב מוקדם יותר, הבולטים על ידי אחד או אפס בקלות מסנטזומים גלויים, יכול לגרום לזמן מבוזבז עקב השהיה ב G2/M התקדמות. לעומת זאת, מבחר של תאים לאחר NEBD תמנע חישוב מדויק של עיתוי mitotic והדמיה של הרכבת צירים מוקדמת ודינמיקה כרומוזום. כמו כן, תאים S2 לעתים קרובות מכילים > 2 סנטרוזומים. למרות אלה בדרך כלל אשכולות לתוך ציר דו קוטבית12, מומלץ למשתמשים הימנעות תאים אלה, אלא אם כן רצוי אחרת עבור העיצוב הניסיוני. תמונות ודיון של תאים מתאימים לבחירה ניתן למצוא בסעיף תוצאות הנציג . לחץ על לחצן הצג חי כדי להתחיל להציג תאים במסך התוכנה. באמצעות כפתור המיקוד העדין של המיקרוסקופ, למקד את התא (או התאים) של עניין. הגדר את בדיקת המיקוד באינפרא-אדום על-ידי לחיצה על לחצן קבע מיקוד הפעל את תוכנית הדימות של הזמן על-ידי לחיצה על לחצן התחל. כוונן את ההיסטגרמות לפי הצורך על-ידי בחירת הערוץ הרצוי והתאמת עוצמות הפיקסלים הממוצע כדי לראות את התא (או התאים) של עניין באופן ברור. אפשר לתוכנית לפעול, בדיקת התא לאחר 15-20 דקות כדי להבטיח את התפלגות המעטפה הגרעינית (NEBD) התרחשה, אשר נקבעת על ידי היעלמות החושך העגול, נקודה שבירה ליד מרכז התא. המשך לאפשר לתוכנית לפעול, בודק לסירוגין (כל 15-20 דקות) כדי לקבוע את התחלתה של אנאפיום. הפסק את התוכנית בשלב זה אם נותר זמן רב יותר בפרק הזמן הכולל ושמור את הקובץ. לחלופין, אם אירועים במהלך telophase ו ציטוקינזה הם מעניינים, לאפשר לתוכנית להפעיל זמן מספיק כדי לצלם תהליכים אלה גם כן. ביצוע ניתוח של NEBD כדי אנאפא עיתוי התחלתה על ידי לציין את הזמן של NEBD (tnebd) בדקות ובזמן שלהפרדת כרומוזום הראשונית (התחלתה של התפרצות) ב דקות והחסרה tnebd מ-tאנאפה בתחילתה כדי להשיג את NEBD כדי אנאפא זמן התחלתה של תא נתון. עשה זאת על ידי לחיצה על לחצן מסגרת למעלה ולציין את המסגרות בהן nebd ו-אנאפה התפרצות להתרחש, חיסור אלה כדי לקבוע את המספר הכולל של מסגרות מחלוף, והכפלת זה לפי מרווח הזמן בין מסגרות הדמיה. המשך בסריקת תאים מראש כדי להשיג מספר n של מצב נתון. תאים ניתן לתמונה בתא לחיות התאים היטב עד 12 שעות לאחר ההסדר הראשוני שלהם.