Ensayos de actividad basados en RMN para determinar la inhibición compuesta, valores IC_50, actividad artifefectiva y actividad de células enteras de ribohidrolasas de nucleósidos

La espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) está bien establecida para caracterizar y controlar las reacciones enzimáticas^1,2. Las diferencias en los cambios químicos y los patrones de acoplamiento se utilizan para distinguir las resonancias de sustratos y productos, y se utilizan intensidades de resonancia relativas para cuantificar el porcentaje de reacción. Tanto el consumo de sustrato como la creación del producto se observan directamente en el espectro de RMN. Esto contrasta con la espectrofotometría o espectroscopia de fluorescencia, en la que el curso del tiempo de reacción se indica por un cambio en la absorbancia atribuible a algunas especies químicas que se consumen o crean. Al igual que con los otros métodos, la RMN se puede utilizar para estudiar las reacciones enzimáticas en función de la temperatura, el pH u otras condiciones de la solución, y se pueden determinar los efectos de los inhibidores.

Más recientemente, se han demostrado ensayos de actividad enzimática basados en RMN para el cribado de fragmentos^3,4. Los ensayos basados en RMN son ideales para trabajar a concentraciones más altas de compuestos de ensayo (a menudo hasta 1 mM) necesarios para detectar estos inhibidores más débiles. El rango dinámico y la dispersión de cambios químicos en el experimento de RMN pueden resolver fácilmente las resonancias de sustrato, producto y compuestos de prueba. Esto se compara favorablemente con los ensayos espectrofotométricos donde los problemas de interferencia de lectura a menudo surgen de compuestos con perfiles de absorción UV-vis superpuestos. Además, dado que carecen de enzimas de reportero, los ensayos de RMN de una sola enzima no son propensos a falsos positivos de ensayo acoplado. Esta ventaja los hace útiles como ensayos ortogonales, complementando losensayos tradicionales de cribado de alto rendimiento y los ensayos de triaje de sobremesa 5.

En nuestro laboratorio de investigación, los ensayos de actividad basados en RMN se utilizan para identificar y evaluar inhibidores de las ribohidrolasas nucleósidos trichomonas vaginales. El parásito T. vaginalis causa la enfermedad de transmisión sexual no viral más prevalente⁶. El aumento de la resistencia a las terapias existentes⁷ está impulsando la necesidad de nuevos tratamientos basados en mecanismos, con enzimas esenciales de la vía de salvamento de nucleósidos que representan objetivos principales^8. Se han desarrollado ensayos de actividad basados en RMN tanto para enzimas específicas de pirimidina como para purina, ribohidrolasa de nucleósido de uridina (UNH)⁹y adenosina/guanosina que prefiriendo ribohidrolasa nucleósido (AGNH)¹⁰. Las reacciones catalizadas por estas dos enzimas se muestran en la Figura1. Los ensayos de RMN se utilizan para examinar bibliotecas de fragmentos para puntos de partida químicos, determinar valores IC₅₀ e eliminar los inhibidores de unión covalente o basados en la agregación¹¹. Los mismos ensayos también se están traduciendo para evaluar la actividad enzimática en células enteras¹².

Se proporcionan protocolos detallados para ensayos compuestos iniciales a 500 m y 250 m, ensayos de dosis-respuesta para determinar los valores de IC_50, ensayos de pantalla de contador de detergente, ensayos de pantalla de contador de saltos-dilución y ensayos en células enteras de E. coli. Los protocolos son generalmente aplicables a cualquier enzima en la que las resonancias de sustrato y producto pueden ser observadas y distinguidas por espectroscopia de RMN. Se han hecho tres suposiciones para la simplicidad. En primer lugar, no se especifica el sustrato. Para que los ensayos de actividad basados en RMN sean útiles, la concentración final de sustrato no debe ser superior a 2-3 veces el valor K_m ⁴. En los ejemplos mostrados, las concentraciones finales de adenosina y5-fluorouridina son de 100 m (K_m a 54 m) y 50 m (K_m a 15 m), respectivamente. En los protocolos, el logro de estas concentraciones corresponde a 12 ml de adenosina de 5 mM o 12 oL de 2,5 mM 5-fluorouridina.

En segundo lugar, se eligió la cantidad de enzima prevista en los protocolos, de 5 ml, para corresponder a la cantidad necesaria para dar lugar a una conversión aproximada del 75% del sustrato al producto en 30 min. Esta cantidad normalmente representa una gran dilución de un stock de enzimas purificadas, y la dilución debe determinarse de antemano para cada enzima. Las soluciones de stock de enzimas AGNH y UNH purificadas se almacenan a -80 oC en alícuotas que proporcionan suficiente enzima para varios miles de reacciones. Por lo tanto, el factor de dilución idealmente sólo necesita ser determinado o validado cada pocos meses. En tercer lugar, no se especifica el experimento específico de RMN 1D. En los resultados representativos, se muestra ¹H NMR para AGNH¹⁰ y ¹⁹F NMR para UNH⁹, con el experimento de RMN descrito en las referencias correspondientes. La elección del experimento de RMN depende de la reacción enzimática y los sustratos disponibles, así como de la instrumentación de RMN disponible. Por último, cabe señalar que el enfoque experimental descrito no se adhiere a los estrictos requisitos de RMN cuantitativa (qNMR)^13,14. En el protocolo, se determina una reacción porcentual utilizando los cambios relativos en la intensidad de la misma resonancia en cada espectro, en lugar de determinar las concentraciones absolutas. Este enfoque elimina la necesidad de adquisición de datos y modificaciones de procesamiento, así como estándares internos o externos, que son necesarios para qNMR.