基于NMR的活性测定,用于测定核苷裂解酶的化合物抑制、IC₅₀值、伪影活性和全细胞活性

核磁共振(NMR)光谱是公认的特征和监测酶反应1,2。化学移变和耦合模式的差异用于区分基板和产品共振,相对共振强度用于量化反应百分比。在NMR光谱中直接观察基板的消耗和产品的产生。这与分光光度或荧光光谱不同,在光谱中,反应时间过程由由于某些化学物种被消耗或产生的吸收力变化来指示。与其他方法一样,NMR 可用于研究酶反应作为温度、pH 或其他溶液条件的函数,并可以确定抑制剂的作用。

最近,基于NMR的酶活性测定已经用于片段筛选3,4。基于 NMR 的检测非常适合检测这些较弱抑制剂所需的较高浓度的测试化合物(通常高达 1 mM)。NMR 实验中的动态范围和化学移位色散可以很容易地解决基材、产品和测试化合物的共振。这与分光光度测定相比,光谱光度测定通常产生与紫外线吸收谱重叠的化合物的读出干扰问题。此外,由于它们缺乏报告酶,单酶NMR检测不易出现耦合检测假阳性。这一优势使它们作为正交测定非常有用,补充了传统的高通量筛选测定和台面分诊测定5。

在我们的研究实验室中,基于 NMR 的活动测定用于识别和评估阴道核苷核氢酶的三氯环比抑制剂。T. 阴道寄生虫引起最普遍的非病毒性传播疾病6.增加对现有疗法7的抗药性正在推动对新型机制治疗的需求,基本核苷抢救通路酶代表主要目标8。基于NMR的活性测定已经开发用于苯丙胺和紫基苯基特异性酶、尿苷核苷核糖酸酶(UNH)9和腺苷/瓜诺辛首选核苷核氢酶(AGNH)10。这两种酶催化的反应如图1所示。NMR检测用于筛选化学起始点的片段库,确定IC50值,并清除基于聚合或共价结合^{抑制剂11。}同样的测定也被翻译来评估整个细胞的酶^活性12。

为500μM和250μM的初始化合物测定、确定IC₅₀值的剂量反应测定、洗涤剂计数器屏幕测定、跳跃稀释计数器筛查和大肠杆菌全细胞测定提供了详细的方案。这些协议通常适用于任何酶,其中基质和产品共振可以通过NMR光谱观察和区分。为简单起见,提出了三个假设。首先,未指定基板。对于基于 NMR 的活动测定有用的,基板的最终浓度不应超过K_m值⁴的 2-3 倍。在所展示的示例中,腺苷和5-氟鲁里丁的最终浓度分别为100μM(K_m =54 μM)和50μM(K_m = 15 μM)。在协议中,达到这些浓度对应于12 μL的5 mM腺苷或12μL的2.5 mM 5氟鲁里丁。

其次,选择协议中规定的酶量5μL,与在30分钟内使基质转化为产品所需的量相对应。此数量通常表示纯化酶库存的较大稀释,并且必须提前确定每种酶的稀释。纯化的AGNH和UNH酶储存溶液储存在-80°C的等分中,为数千次反应提供足够的酶。因此,稀释因子理想情况下只需要每隔几个月确定或验证一次。第三,未指定特定的 1D NMR 实验。在代表性结果中,为AGNH¹⁰显示1H NMR,为UNH^9显示19FNMR,并在相应的参考中描述了NMR实验。NMR 实验的选择取决于可用的酶反应和基质以及可用的 NMR 仪器。最后,应该指出,所述的实验方法不符合定量NMR(qNMR)13、14的严格要求。在协议中,使用每个光谱中相同共振强度的相对变化,而不是通过确定绝对浓度来确定百分比反应。此方法消除了数据采集和处理修改以及 qNMR 所需的内部或外部标准的需求。