ЯМР-анализ ы активности для определения ингибирования соединения, IC₅₀ Значения, Артефактная активность, и цельноклеточной активности нуклеозидных рибогидроласов

Ядерная магнитно-резонансная (НМР) спектроскопия хорошозарекомендовала себя для характеристики и мониторинга ферментных реакций 1,². Различия в химических сдвигов и связывая моделей используются для различения субстрата и резонансов продукта, а относительная интенсивность резонанса используется для количественной оценки процента реакции. Как потребление субстрата, так и создание продукта непосредственно наблюдаются в спектре ЯМР. Это контрастирует со спектрофотометрией или флуоресценцией спектроскопии, в которой время реакции указывается на изменение абсорбции, связанные с некоторыми химическими видами потребляется или создается. Так же, как с другими методами, ЯМР может быть использован для изучения ферментных реакций в качестве функции температуры, рН, или других условий раствора, и эффекты ингибиторов могут быть определены.

Совсем недавно, На основе ЯМР ферментной активности анализы были продемонстрирована для фрагмента скрининга^3,4. Анализы на основе ЯМР идеально подходят для работы при более высоких концентрациях испытательных соединений (часто до 1 мМ), необходимых для обнаружения этих более слабых ингибиторов. Динамический диапазон и дисперсия химических сдвигов в эксперименте NMR могут легко разрешить резонансы от субстрата, продукта и испытательных соединений. Это выгодно отличается от спектрофотометрических анализов, где проблемы ссчитывания помех часто возникают из соединений с перекрывающимися УФ-вис абсорбционными профилями. Кроме того, поскольку им не хватает региней репортера, одноэнзимные анализы ЯМР не склонны к сочетанию с ложными срабатываниями. Это преимущество делает их полезными в качестве ортогоналовых анализов, дополняя традиционныеанализы скрининга высокой пропускной их связи и анализы сортировки скамейки 5.

В нашей исследовательской лаборатории, На основе ЯМР анализы активности используются для выявления и оценки ингибиторов Trichomonas вагинального нуклеозида рибогидроласы. T. вагинальный паразит вызывает наиболее распространенные невирусные венерические заболевания⁶. Растущая устойчивость к существующим терапии⁷ является движущей необходимость новых, механизм на основе лечения, с основными нуклеозидных спасти пути ферментов, представляющих основные цели⁸. Анализы активности на основе ЯМР были разработаны как для пиримидин- и пурино-специфических ферментов, нуклеозидного арибогидролазы уридина (UNH)⁹, и аденозин/гуанозин предпочитая нуклеозид рибогидролазы (AGNH)¹⁰. Реакции, катализированные этими двумя ферментами, показаны на рисунке 1. Анализы NMR используются для проверки библиотек фрагментов для химических исходных точек, определения значений IC₅₀ и отсечения агрегационных или ковалентных связывающих ингибиторов^11. Те же ассисты также переводятся для оценки активности ферментов в целых клетках^12.

Подробные протоколы предусмотрены для первоначальных анализов соединения на 500 мкм и 250 мкм, дозы-ответ анализы для определения значения IC_50, моющее средство счетчик проверки экрана, скачок-разбавления счетчик анализы экрана, и анализы в E. coli целые клетки. Протоколы, как правило, применимы к любому ферменту, в котором субстрат и резонанспродукта продукта могут наблюдаться и отличаться спектроскопией ЯМР. Для простоты были сделаны три предположения. Во-первых, субстрат не указан. Для того чтобы анализы активности на основе ЯМР были полезными, конечная концентрация субстрата должна быть не более 2-3x значение K_m ^4. В приведенных примерах конечная концентрация аденозина и 5-фтороридинасоставляют 100 мкм (Км м 54 мкм) и 50 мм (К_м 15 мКм), соответственно. В протоколах достижение этих концентраций соответствует 12 мл аденозина 5 мМ или 12 мЛ 2,5 мМ 5-фтороридина.

Во-вторых, количество фермента, предусмотренное в протоколах, 5 зЛ, было выбрано в соответствии с количеством, необходимым для преобразования субстрата примерно на 75% в продукт за 30 мин. Это количество обычно представляет собой большое разбавление из очищенного ферментного запаса, и разбавление должно быть определено заранее для каждого фермента. Очищенные растворы agNH и UNH ферментного запаса хранятся при -80 градусов по Цельсию в аликвотах, которые обеспечивают достаточное количество ферментов для нескольких тысяч реакций. Таким образом, коэффициент разбавления в идеале должен определяться или проверяться только каждые несколько месяцев. В-третьих, конкретный эксперимент 1D NMR не указан. В репрезентативных результатах показан ¹H NMR для AGNH¹⁰ и ¹⁹F NMR для UNH^9,при этом эксперимент ЯМР описан в соответствующих ссылках. Выбор эксперимента ЯМР зависит от ферментной реакции и доступных субстратов, а также от доступных приборов NMR. Наконец, следует отметить, что описанный экспериментальный подход не соответствует строгим требованиям количественных NMR (qNMR)^13,14. В протоколе процентная реакция определяется с использованием относительных изменений интенсивности одного и того же резонанса в каждом спектре, а не путем определения абсолютных концентраций. Такой подход устраняет необходимость в модификациях для сбора и обработки данных, а также внутренних или внешних стандартов, которые необходимы для qNMR.