화합물 억제, IC50 값, 관절 활성 및 뉴클레오시드 리보하이드라제의 전세포 활성을 결정하기 위한 NMR 기반 활성 반응
Summary
NMR 기반 활성 세포는 2개의 뉴클레오시드 리보하이드로라제 효소의 억제제를 식별하고 특성화하기 위해 개발되었다. 프로토콜은 500 μM 및 250 μM에서 초기 화합물 분석, IC50 값, 세제 카운터 스크린 분석, 점프 희석 카운터 스크린 분석, 및 대장균 전체 세포에서 분석법을 결정하기 위한 투여 량 반응 분석법을 위해 제공된다.
Abstract
NMR 분광법은 약물 발견에서 효소 억제제의 식별 및 특성화, 특히 단편 스크리닝의 맥락에서 종종 사용됩니다. NMR 기반 활성 측정은 이러한 약한 억제제를 검출하는 데 필요한 시험 화합물의 고농도에서 작업하는 데 이상적입니다. NMR 실험에서 다이나믹 레인지및 화학적 시프트 분산은 기판, 제품 및 테스트 화합물의 공명을 쉽게 해결할 수 있습니다. 이는 UV-vis 흡수 프로파일이 겹치는 화합물에서 판독 간섭 문제가 종종 발생하는 분광광도 측정 분석과 대조됩니다. 또한, 리포터 효소가 부족하기 때문에, 단일 효소 NMR 분석법은 결합-분석 거짓 양성에 취약하지 않다. 이 속성은 전통적인 높은 처리량 검열 검문 및 벤치탑 분류 검문 검사를 보완하는 직교 검문 검사로 그(것)들을 유용하게 합니다. 상세한 프로토콜은 500 μM 및 250 μM에서 초기 화합물 분석, IC50 값, 세제 카운터 스크린 분석, 점프 희석 카운터 스크린 분석, 및 대장균 전체 세포에서 분석법을 결정하기 위한 투여 량 반응 분석법을 위해 제공된다. 이 방법은 2개의 뉴클레오시드 리보하이드로라제 효소를 사용하여 입증된다. 1H NMR의 사용은 푸린 특이적 효소에 대해, 19F NMR은 피리미딘 특이적 효소에 대해 나타난 다. 프로토콜은 일반적으로 기질 및 생성물 공진이 NMR 분광법에 의해 관찰되고 구별될 수 있는 모든 효소에 적용됩니다. 약물 발견의 맥락에서 가장 유용하게 사용하려면, 기판의 최종 농도는 Km 값의 2-3 배 이상이어야한다. NMR 실험의 선택은 사용 가능한 효소 반응 및 기질뿐만 아니라 사용 가능한 NMR 계측에 달려 있습니다.
Introduction
핵 자기 공명 (NMR) 분광법은 효소 반응을 특성화하고 모니터링하기위한 잘 확립되어 있습니다 1,2. 화학 적 변화와 커플링 패턴의 차이는 기판과 제품 공명을 구별하는 데 사용되며 상대 공명 강도는 반응의 백분율을 정량화하는 데 사용됩니다. 기판의 소비와 제품의 생성은 모두 NMR 스펙트럼에서 직접 관찰된다. 이는 분광광도법 또는 형광 분광법과 대조되는데, 반응 시간 과정은 일부 화학 종에 기인하는 흡광도의 변화로 인해 소비되거나 생성됩니다. 다른 방법과 마찬가지로 NMR은 효소 반응을 온도, pH 또는 다른 용액 조건의 함수로 연구하는 데 사용할 수 있으며 억제제의 효과를 결정할 수 있습니다.
보다 최근에는, NMR 계 효소 활성 성검사가 단편 스크리닝 3,4에대해 입증되었다. NMR 기반 측정은 이러한 약한 억제제를 검출하는 데 필요한 시험 화합물(종종 1mMM)의 고농도에서 작업하는 데 이상적입니다. NMR 실험에서 다이나믹 레인지및 화학적 시프트 분산은 기판, 생성물 및 테스트 화합물의 공명을 쉽게 해결할 수 있습니다. 이는 UV-vis 흡수 프로파일이 겹치는 화합물에서 판독 간섭 문제가 종종 발생하는 분광광도 측정 분석과 유리하게 비교됩니다. 또한, 리포터 효소가 부족하기 때문에, 단일 효소 NMR 분석법은 결합-분석 거짓 양성에 취약하지 않다. 이러한 장점은 기존의 높은 처리량 선별 검문 및 벤치탑 심사 검문 5를 보완하는 직교 검문 검사로 유용하게 만듭니다.
우리의 연구 실험실에서, NMR 기지를 둔 활동 시험은 트리코모나스 질 핵핵리보하이드라제의 억제제기준을 확인하고 평가하기 위하여 이용됩니다. 상기 T. 질성 기생충은 가장 널리 퍼진 비바이러스성 성병6을일으킨다. 기존 치료법에 대한 저항성 증가 7은 주요 표적을 나타내는 필수 뉴클레오시드 인양 경로 효소와 함께 새로운 메커니즘 기반 치료법에 대한 필요성을 주도하고있다8. NMR 기반 활성 세포는 피리미딘- 및 푸린 특이적 효소, 우리딘 뉴클레오시드 리보하이드라제(UNH)9,및 아데노신/구아노신을 선호하는 뉴클레오시드 리보하이드로라제(AGNH)10모두에 대해 개발되었다. 이 두 효소에 의해 촉매작용된 반응은 그림1에 나타내었다. NMR 분석을 사용하여 화학적 시작점에 대한 단편 라이브러리를 스크리팅하고, IC50 값을 결정하고, 응집기반 또는 공유 결합 억제제(11)를 잡초아웃한다. 동일한 아세이역시 전체 세포에서 효소 활성을 평가하기 위해 번역되고있다 12.
상세한 프로토콜은 500 μM 및 250 μM에서 초기 화합물 분석, IC50 값, 세제 카운터 스크린 분석, 점프 희석 카운터 스크린 분석, 및 대장균 전체 세포에서 분석법을 결정하기 위한 투여 량 반응 분석법을 위해 제공된다. 프로토콜은 일반적으로 기질 및 생성물 공진이 NMR 분광법에 의해 관찰되고 구별될 수 있는 모든 효소에 적용됩니다. 단순성에 대한 세 가지 가정이 만들어졌습니다. 첫째, 기판은 지정되지 않는다. NMR 기반 활성 반응의 유용성을 위해, 기판의 최종 농도는 Km 값 4의2-3배 이하이어야 한다. 도시된 예에서, 아데노신 및 5-플루오로우리딘의 최종 농도는 각각 100 μM(Km = 54 μM) 및 50 μM(Km= 15 μM)이다. 프로토콜에서, 이들 농도를 달성하는 것은 5 mM 아데노신의 12 μL 또는 2.5 mM 5-플루오루리딘의 12 μL에 해당한다.
둘째, 프로토콜에 제공된 효소의 양은 5 μL로, 30분 내에 기질의 약 75% 변환을 초래하는 데 필요한 양에 대응하기 위해 선택되었다. 이러한 양은 전형적으로 정제된 효소 스톡으로부터 큰 희석을 나타내며, 희석은 각 효소에 대해 미리 결정되어야 한다. 정제된 AGNH 및 UNH 효소 스톡 용액은 수천 개의 반응에 충분한 효소를 제공하는 양현표에 -80°C에 저장됩니다. 따라서, 희석 계수는 이상적으로 단지 몇 개월마다 결정되거나 검증될 필요가 있다. 셋째, 특정 1D NMR 실험은 지정되지 않았다. 대표적인 결과에서, 1H NMR은 UNH 9에 대해 도시된 AGNH10 및 19F NMR에 대해 도시되며, 해당 참조에 기재된 NMR 실험과 함께 도시된다. NMR 실험의 선택은 사용 가능한 효소 반응 및 기질뿐만 아니라 사용 가능한 NMR 계측에 달려 있습니다. 마지막으로, 설명된 실험 접근법이 정량적 NMR(qNMR)13,14의엄격한 요건을 준수하지 않는다는 점을 지적해야 한다. 프로토콜에서 백분율 반응은 절대 농도를 결정하는 것이 아니라 각 스펙트럼에서 동일한 공진의 강도의 상대적 변화를 사용하여 결정됩니다. 이 방법을 사용하면 qNMR에 필요한 내부 또는 외부 표준뿐만 아니라 데이터 수집 및 처리 수정이 필요하지 않습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
기질 및/또는 제품이 NMR 스펙트럼에서 용해 가능한 신호를 가지고 있는 경우, 설명된 프로토콜은 일반적으로 많은 효소에 적용가능하다. 그러나, 기판의 농도가 그 Km 값에 가깝고 합리적인 기간 내에 NMR 실험에서 검출될 수 있을 만큼 충분히 높다는 것이 중요하다. 기판 농도가 2-3배 이하인 Km 값은 경쟁력, 비경쟁성 및 비경쟁 억제제 4를 검출하는 데 최적입니다.<sup c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
아스트라제네카 단편 라이브러리에서 화합물을 제공한 딘 브라운 박사와 AGNH 및 UNH 효소를 제공한 데이비드 파친 박사에게 감사드립니다. 이 간행물에 보고된 연구는 B. J. S에 상 번호 R15AI128585의 밑에 건강의 국가 학회의 알레르기그리고 감염증의 국가 학회에 의해 지원되었습니다. 이 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 보건원의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다.연구 는 또한 Horace G. McDonell 여름 연구 펠로우십에 의해 지원되었다 S. N. M., Landesberg 가족 J. A. G., 교수 개발 보조금 및 아델피 대학에서 B. J. S에 프레드릭 베텔하임 연구 상수여.
Materials
| AGNH | Purified in-house | N/A | TVAG_213720 |
| UNH | Purified in-house | N/A | TVAG_092730 |
| Adenosine | Sigma | A9251 | |
| 5-Fluorouridine | Sigma | F5130 | |
| Dimethyl sulfoxide-D6 | Cambridge Isotope Labs | DLM-10-100 | D, 99.9% |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P0662 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma | P3786 | |
| Potassium chloride | Sigma | P9541 | |
| Deuterium oxide | Cambridge Isotope Labs | DLM-4-100 | D, 99.9% |
| Hydrochloric acid | Fisher Chemical | A144212 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| 3-(Trimethylsilyl)propionic-2,2,3,3,-d4 acid sodium salt (TSP) | Sigma | 269913 | D, 98% |
| 2,2,2-Trifluoroethanol-1,1-d2 | Sigma | 612197 | D, 99.5% |
| Pipette | Gilson | F123602 | PIPETMAN Classic P1000 |
| Pipette | Gilson | F123601 | PIPETMAN Classic P200 |
| Pipette | Gilson | F123600 | PIPETMAN Classic P20 |
| Microfuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Conical tubes | Corning | 352099 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5418 | |
| Vortex mixer | Fisher Scientific | 02215365 | |
| NMR tubes | Norell | 502-7 | Or as appropriate for the NMR |
| NMR spectrometer | Bruker | N/A | AvanceIII500 |
| Prism software | GraphPad | N/A | Version 5.04 |
References
- Jardetzky, O., Roberts, G. C. K. . NMR in Molecular Biology. , (1981).
- Evans, J. N. S. . Biomolecular NMR spectroscopy. , (1995).
- Dalvit, C., et al. A general NMR method for rapid, efficient, and reliable biochemical screening. Journal of the American Chemical Society. 125, 14620-14625 (2003).
- Dalvit, C. Ligand- and substrate-based 19F NMR screening: Principles and applications to drug discovery. Progress in NMR Spectroscopy. 51, 243-271 (2007).
- Stockman, B. J., et al. Identification of allosteric PIF-pocket ligands for PDK1 using NMR-based fragment screening and 1H-15N TROSY experiments. Chemical Biology & Drug Design. 73, 179-188 (2009).
- Hirt, R. P., Sherrard, J. Trichomonas vaginalis origins, molecular pathobiology and clinical considerations. Current Opinion in Infectious Diseases. 28, 72-79 (2015).
- Conrad, M. D., Bradic, M., Warring, S. D., Gorman, A. W., Carlton, J. M. Getting trichy: Tools and approaches to interrogating Trichomonas vaginalis in a post-genome world. Trends in Parasitology. 29 (2013), 17-25 (2013).
- Versées, W., Steyaert, J. Catalysis by nucleoside hydrolases. Current Opinion in Structural Biology. 13, 731-738 (2003).
- Shea, T. A., et al. Identification of proton-pump inhibitor drugs that inhibit Trichomonas vaginalis uridine nucleoside ribohydrolase. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 24, 1080-1084 (2014).
- Beck, S., Muellers, S. N., Benzie, A. L., Parkin, D. W., Stockman, B. J. Adenosine/guanosine preferring nucleoside ribohydrolase is a distinct, druggable antitrichomonal target. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 25, 5036-5039 (2015).
- Muellers, S. N., et al. Ligand-efficient inhibitors of Trichomonas vaginalis adenosine/guanosine preferring nucleoside ribohydrolase. ACS Infectious Diseases. 5, 345-352 (2019).
- Veronesi, M., et al. Fluorine nuclear magnetic resonance-based assay in living mammalian cells. Analytical Biochemistry. 495, 52-59 (2016).
- Holzgrabe, U. Quantitative NMR spectroscopy in pharmaceutical applications. Progress in NMR Spectroscopy. 57, 229-240 (2010).
- Bharti, S. K., Roy, R. Quantitative 1H NMR spectroscopy. Trends in Analytical Chemistry. 35, 5-26 (2012).
- Dalvit, C., et al. Sensitivity improvement in 19F NMR-based screening experiments: Theoretical considerations and experimental applications. Journal of the American Chemical Society. 127, 13380-13385 (2005).
- Lambruschini, C., et al. Development of fragment-based n-FABS NMR screening applied to the membrane enzyme FAAH. ChemBioChem. 14, 1611-1619 (2013).
- Stockman, B. J. 2-Fluoro-ATP as a versatile tool for 19F NMR-based activity screening. Journal of the American Chemical Society. 130, 5870-5871 (2008).
- Aldrich, C., et al. The ecstasy and agony of assay interference compounds. ACS Central Science. 3, 143-147 (2017).
- Feng, B. Y., Shoichet, B. K. A detergent-based assay for the detection of promiscuous inhibitors. Nature Protocols. 1, 550-553 (2006).
- Copeland, R. A., Basavapathruni, A., Moyer, M., Scott, M. P. Impact of enzyme concentration and residence time on apparent activity recovery in jump dilution analysis. Analytical Biochemistry. , 206-210 (2011).
- Griveta, J. -. P., Delort, A. -. M. NMR for microbiology: In vivo and in situ applications. Progress in NMR Spectroscopy. 54, 1-53 (2009).
- Nijman, S. M. B. Functional genomics to uncover drug mechanism of action. Nature Chemical Biology. 11, 942-948 (2015).
