Foram desenvolvidos ensaios de atividade com base em RMN para identificar e caracterizar inibidores de duas enzimas de riboidrolase nucleósidas. Os protocolos são fornecidos para ensaios compostos iniciais em 500 μM e 250 μM, ensaios de dose-resposta para a determinação de valores de IC50 , ensaios de tela de contador de detergente, ensaios de tela de contador de diluição de salto e ensaios em células inteiras de e. coli .
A espectroscopia de RMN é freqüentemente utilizada para a identificação e caracterização de inibidores enzimáticos na descoberta de fármacos, particularmente no contexto de triagem de fragmentos. Os ensaios de atividade baseados em RMN são ideais para trabalhar nas concentrações mais elevadas de compostos de teste necessários para detectar esses inibidores mais fracos. A escala dinâmica e a dispersão química do deslocamento em uma experimentação de RMN podem facilmente resolver ressonâncias do substrato, do produto, e dos compostos do teste. Isso contrasta com os ensaios espectrofotométricos, nos quais os problemas de interferência de leitura geralmente surgem de compostos com perfis de absorção UV-VIS sobrepostos. Além, desde que faltam enzimas do repórter, os ensaios da RMN da único-enzima não são propensas aos falsos positivos acoplados-ensaio. Este atributo os torna úteis como ensaios ortogonais, complementando os ensaios tradicionais de triagem de alta taxa de transferência e ensaios de triagem de bancada. Os protocolos detalhados são fornecidos para ensaios compostos iniciais em 500 μM e 250 μM, ensaios de dose-resposta para a determinação de valores de IC50 , ensaios de tela de contador de detergente, ensaios de tela de contador de diluição de salto e ensaios em células inteiras de e. coli . Os métodos são demonstrados usando duas enzimas do ribohydrolase do nucleosídeo. O uso de 1H NMR é mostrado para a enzima purine-específica, quando 19F NMR for mostrado para a enzima pyrimidine-específica. Os protocolos são geralmente aplicáveis a qualquer enzima onde as ressonâncias de substrato e produto podem ser observadas e distinguidas por espectroscopia de RMN. Para ser o mais útil no contexto da descoberta de drogas, a concentração final de substrato deve ser não mais do que 2-3x seu valor de Km . A escolha do experimento de RMN depende da reação enzimática e dos substratos disponíveis, bem como da instrumentação de RMN disponível.
A espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN) é bem estabelecida para caracterizar e monitorar as reações enzimáticas1,2. As diferenças nos deslocamentos químicos e nos padrões de acoplamento são usadas para distinguir as ressonâncias do substrato e do produto, e as intensidades de ressonância relativas são usadas para quantificar o percentual de reação. Tanto o consumo de substrato quanto a criação do produto são observados diretamente no espectro de RMN. Isso contrasta com a espectrofotometria ou espectroscopia de fluorescência, na qual o curso de tempo de reação é indicado por uma alteração na absorvência atribuível a algumas espécies químicas que estão sendo consumidas ou criadas. Assim como com os outros métodos, RMN pode ser usado para estudar as reações enzimáticas em função da temperatura, pH, ou outras condições da solução, e os efeitos dos inibidores podem ser determinados.
Mais recentemente, foram demonstrados os ensaios de atividade enzimática baseada em RMN para a triagem de fragmentos3,4. Os ensaios baseados em RMN são ideais para trabalhar nas concentrações mais elevadas de compostos de ensaio (frequentemente tão elevados como 1 mM) necessários para detectar estes inibidores mais fracos. A escala dinâmica e a dispersão química do deslocamento na experimentação de RMN podem facilmente resolver ressonâncias do substrato, do produto, e dos compostos do teste. Isto compara favoràvel aos ensaios espectrofotométricos onde os problemas da interferência da leitura-para fora levantam-se frequentemente dos compostos com perfis de absorção UV-VIS de sobreposição. Além, desde que faltam enzimas do repórter, os ensaios da RMN da único-enzima não são propensas aos falsos positivos acoplados-ensaio. Essa vantagem os torna úteis como ensaios ortogonais, complementando os ensaios tradicionais de triagem de alta produtividade e os ensaios de triagens de bancada5.
Em nosso laboratório de pesquisa, os ensaios de atividade baseados em RMN são usados para identificar e avaliar os inibidores de Trichomonas vaginalis nucleosídeo ribohydrolases. O parasita T. vaginalis causa a doença sexualmente transmissível não viral mais prevalente6. Aumentar a resistência às terapias existentes7 está conduzindo a necessidade para tratamentos novos, mecanismo-baseados, com as enzimas essenciais do caminho do salvamento do nucleosídeo que representam alvos principais8. Foram desenvolvidos ensaios de atividade baseados em RMN para as enzimas pirimidina e Purina específicas, a ribohydrolase do nucleosídeo uridina (UNH)9e a adenosina/guanosina preferindo a ribohidlase nucleosídeo (agnh)10. As reações catalisadas por estas duas enzimas são mostradas na Figura 1. Os ensaios de RMN estão sendo usados para fazer a tela de bibliotecas de fragmentos para pontos de partida químicos, determinar os valores de IC50 e eliminar inibidores de ligação com base em agregação ou covalentes11. Os mesmos ensaios também estão sendo traduzidos para avaliar a atividade enzimática em células inteiras12.
Os protocolos detalhados são fornecidos para ensaios compostos iniciais em 500 μM e 250 μM, ensaios de dose-resposta para a determinação de valores de IC50 , ensaios de tela de contador de detergente, ensaios de tela de contador de diluição de salto e ensaios em células inteiras de e. coli . Os protocolos são geralmente aplicáveis a qualquer enzima em que as ressonâncias de substrato e produto podem ser observadas e distinguidas pela espectroscopia de RMN. Três suposições foram feitas para a simplicidade. Primeiro, o substrato não é especificado. Para que os ensaios de atividade baseados em RMN sejam úteis, a concentração final do substrato deve ser não superior a 2-3x o valor de Km 4. Nos exemplos mostrados, as concentrações finais de adenosina e 5-fluorouridina são 100 μM (km = 54 μM) e 50 μm (km = 15 μm), respectivamente. Nos protocolos, atingir estas concentrações corresponde a 12 μL de 5 mM de adenosina ou 12 μL de 2,5 mM 5-fluorouridina.
Em segundo lugar, a quantidade de enzima prevista nos protocolos, 5 μL, foi escolhida para corresponder à quantidade necessária para resultar em aproximadamente 75% de conversão do substrato para o produto em 30 min. Esta quantidade representa tipicamente uma grande diluição de um estoque purified da enzima, e a diluição deve ser determinada adiantado para cada enzima. As soluções de estoque de enzimas purificadas AGNH e UNH são armazenadas em-80 ° c em alíquotas que fornecem enzima suficiente para várias milhares de reações. Assim, o fator de diluição idealmente só precisa ser determinado ou validado a cada poucos meses. Em terceiro lugar, o experimento NMR 1D específico não é especificado. Nos resultados representativos, 1H NMR é mostrado para agnh10 e 19F NMR é mostrado para unh9, com o experimento de RMN descrito nas referências correspondentes. A escolha do experimento de RMN depende da reação enzimática e dos substratos disponíveis, bem como da instrumentação de RMN disponível. Por fim, deve-se salientar que a abordagem experimental descrita não adere às rigorosas exigências da RMN quantitativa (qnmr)13,14. No protocolo, uma reação percentual é determinada usando as alterações relativas na intensidade da mesma ressonância em cada espectro, em vez de determinar concentrações absolutas. Essa abordagem elimina a necessidade de aquisição de dados e modificações de processamento, bem como padrões internos ou externos, que são necessários para qNMR.
Os protocolos descritos são geralmente aplicáveis a muitas enzimas, desde que os substratos e/ou produtos tenham sinais resolvíveis no espectro de RMN. No entanto, é crítico que a concentração de substrato está perto de seu valor de Km e alta o suficiente para ser detectado em um experimento de RMN dentro de um prazo razoável. Uma concentração de substrato não superior a 2-3x o valor de Km é ideal para detectar inibidores competitivos, não competitivos e não competit…
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos ao Dr. Dean Brown por fornecer compostos da biblioteca de fragmentos AstraZeneca e do Dr. David Parkin para fornecer as enzimas AGNH e UNH. A pesquisa relatada nesta publicação foi apoiada pelo Instituto Nacional de alergia e doenças infecciosas dos institutos nacionais de saúde o prêmio número R15AI128585 a B. J. S. O conteúdo é unicamente da responsabilidade dos autores e não representa necessariamente os pontos de vista oficiais dos institutos nacionais de saúde. a Research também foi apoiada por um Horace G. McDonell Summer Research Fellowship concedida a S. N. M., uma família Landesberg Bolsa concedida a J. A. G., e bolsas de desenvolvimento do corpo docente e prêmio de pesquisa Frederick Bettelheim da Universidade Adelphi para B. J. S.
AGNH | Purified in-house | N/A | TVAG_213720 |
UNH | Purified in-house | N/A | TVAG_092730 |
Adenosine | Sigma | A9251 | |
5-Fluorouridine | Sigma | F5130 | |
Dimethyl sulfoxide-D6 | Cambridge Isotope Labs | DLM-10-100 | D, 99.9% |
Potassium phosphate monobasic | Sigma | P0662 | |
Potassium phosphate dibasic | Sigma | P3786 | |
Potassium chloride | Sigma | P9541 | |
Deuterium oxide | Cambridge Isotope Labs | DLM-4-100 | D, 99.9% |
Hydrochloric acid | Fisher Chemical | A144212 | |
Triton X-100 | Sigma | X100 | |
3-(Trimethylsilyl)propionic-2,2,3,3,-d4 acid sodium salt (TSP) | Sigma | 269913 | D, 98% |
2,2,2-Trifluoroethanol-1,1-d2 | Sigma | 612197 | D, 99.5% |
Pipette | Gilson | F123602 | PIPETMAN Classic P1000 |
Pipette | Gilson | F123601 | PIPETMAN Classic P200 |
Pipette | Gilson | F123600 | PIPETMAN Classic P20 |
Microfuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
Conical tubes | Corning | 352099 | |
Microcentrifuge | Eppendorf | 5418 | |
Vortex mixer | Fisher Scientific | 02215365 | |
NMR tubes | Norell | 502-7 | Or as appropriate for the NMR |
NMR spectrometer | Bruker | N/A | AvanceIII500 |
Prism software | GraphPad | N/A | Version 5.04 |