NMR-מבוסס על פעילות מבוססת על קביעת עיכוב מורכבים, IC₅₀ ערכים, פעילות פרועובדתית, ואת הפעילות התא כולו של נוקלאוטילסייד הריבוליטיות

תהודה מגנטית גרעינית (nmr) ספקטרוסקופיית מבוססת היטב לאפיון וניטור של תגובות אנזימים^1,2. הבדלים במשמרות כימיים ודפוסי צימוד משמשים להבחנה בין המצע לבין מוצרים, ועוצמות תהודה יחסיות משמשות לכמת את אחוז התגובה. הן צריכת המצע והן יצירת המוצר מתבוננים ישירות בספקטרום NMR. זה נוגד את הספקטרוסקופיית הספקטרופוטומטר או הפלואורסצנטית, שבו קורס זמן התגובה מצוין על ידי שינוי בספיגה המיוחס למינים כימיים שנצרכים או נוצרו. בדיוק כמו עם שיטות אחרות, NMR יכול לשמש כדי ללמוד תגובות אנזימים כפונקציה של טמפרטורה, pH, או תנאי פתרון אחרים, ואת ההשפעות של מעכבי ניתן לקבוע.

לאחרונה, nmr-מבוססי האנזים פעילות אנזימים הוכחו עבור הקרנת קטע^3,4. Nmr מבוסס בחני מתאים באופן אידיאלי לעבוד בריכוזים גבוהים יותר של תרכובות מבחן (לעתים קרובות גבוה כמו 1 מ”מ) נדרש כדי לזהות אלה מעכבי חלשים. הטווח הדינמי ופיזור המשמרת הכימית בניסוי NMR יכול בקלות לפתור מהדהד ממצע, מוצר, ותרכובות בדיקה. זה משווה בחיוב על spectrophotometric בחני היכן בעיות התערבות קריאה-out מתעוררות לעתים קרובות מתרכובות עם פרופילי UV-vis חופפים. בנוסף, מאז הם חסרי אנזימים עיתונאי, האנזים היחיד nmr בחני אינם נוטים להיות מצמידים משולב חיוביות שווא. יתרון זה הופך אותם לשימושיים כגון אורתוגונאליות, משלימים את ההקרנה המסורתית של הקרנת תפוקה גבוההומיון שחקן ראשי.

במעבדת המחקר שלנו, בחני-מבוסס על הפעילות המבוססת משמשים כדי לזהות ולהעריך מעכבי של trichomonas וגיפרוציץ נוקלאוסייד ריבוליסיס. הטפיל ה -T וגינגיט גורם למחלות המועברות במין הלא-נגיפית הנפוצות ביותר⁶. התנגדות הגוברת לטיפולים הקיימים⁷ הוא המניע את הצורך הרומן, מנגנון מבוססי טיפולים, עם מסלול הצלה נוקלאוטיבצד העיקרי המייצג יעדים ראשוניים⁸. NMR-מבוסס על פעילות שפותחה עבור pyrimidine ו-purine הסגולי, ולאחר הריבוהידקלז נוקלאוטיל⁹, ו אדנוזין/guanosine העדפת נוקלאוטיההידרוקלז (agnh)¹⁰. התגובות מזרז על ידי שני אנזימים אלה מוצגים באיור 1. Nmr בחני נמצאים בשימוש כדי להקרין ספריות קטע עבור נקודות ההתחלה כימיים, לקבוע את IC₅₀ ערכים, ולעשב מתחת מעכבי מבוסס מצבור או מעכבים כריכה מבוססת¹¹. אותו הדבר גם להיות מתורגם כדי להעריך את פעילות האנזים בתאים שלמים¹².

פרוטוקולים מפורטים מסופקים עבור בחני התרכובת הראשונית ב 500 μm ו 250 μm, מינון התגובה בחני לקביעת ערכי IC₅₀ , ניקוי המונה המסך מונה, לקפוץ-דילול מונה מסך בחני, ו בחני בתאי E. coli שלם. הפרוטוקולים חלים בדרך כלל על כל אנזים שבו ניתן להבחין במצע ומוצרי מוצר ולהבחין בספקטרוסקופיית NMR. . שלוש הנחות נעשו לפשטות ראשית, המצע לא צוין. עבור הפעילות nmr-מבוסס בחני אומר להיות שימושי, הריכוז הסופי של מצע צריך להיות לא יותר מ 2-3x הערך K_m ⁴. בדוגמאות המוצגות, הריכוזים הסופיים של אדנוזין ו 5-פלואורוורידין הם 100 μM (k_m = 54 μm) ו 50 μm (k_m = 15 μm), בהתאמה. בפרוטוקולים, השגת ריכוזים אלה מתאים 12 μL של 5 מ”מ אדנוזין או 12 μL של 2.5 mM 5-פלואור.

שנית, כמות האנזים המסופק עבור בפרוטוקולים, 5 μL, נבחר להתאים את הסכום הנדרש כדי לגרום כ 75% המרה של מצע למוצר בתוך 30 דקות. כמות זו מייצגת בדרך כלל דילול גדול ממניות אנזימים מטוהרים, והדילול חייב להיקבע מראש לכל אנזים. מטוהרים AGNH ופתרונות מלאי אנזימים מאוחסנים ב-80 ° c ב ali, אשר מספקים מספיק אנזים עבור כמה אלפי תגובות. לפיכך, גורם הדילול באופן אידיאלי צריך להיקבע או להיות מאומת כל כמה חודשים. שלישית, ניסוי 1D NMR הספציפי לא צוין. בתוצאות הנציג, ¹H nmr מוצג עבור agnh¹⁰ ו- ¹⁹F nmr מוצג עבור ללא⁹, עם ניסוי nmr המתואר ההפניות המתאימות. הבחירה של הניסוי NMR תלוי בתגובת אנזימים ומצעים זמינים, כמו גם מכשור NMR זמין. לבסוף, יש לציין כי הגישה הניסיונית תיאר אינו תואם את הדרישות הקפדניות של nmr כמותי (qnmr)^13,14. בפרוטוקול, תגובת אחוז נקבעת באמצעות השינויים היחסיים באינטנסיביות של אותה תהודה בכל קשת, ולא על-ידי קביעת ריכוזים מוחלטים. גישה זו מבטלת את הצורך ברכישת נתונים ועיבוד שינויים, כמו גם סטנדרטים פנימיים או חיצוניים, אשר נדרשים qNMR.