Assaggi di attività basati su NMR per determinare l'inibizione composta, i valori IC_50, l'attività Artifactual e l'attività intera delle cellule

La spettroscopia a risonanza magnetica nucleare (NMR) è ben consolidata per caratterizzare e monitorare le reazioni enzimatiche^1,2. Le differenze nei cambiamenti chimici e nei modelli di accoppiamento vengono utilizzate per distinguere le risonanze di substrato e prodotto, mentre le intensità di risonanza relativa vengono utilizzate per quantificare la percentuale di reazione. Sia il consumo di substrato che la creazione di prodotto sono osservati direttamente nello spettro NMR. Ciò contrasta con la spettrofotometria o la spettroscopia a fluorescenza, in cui il corso temporale di reazione è indicato da un cambiamento di assorbimento attribuibile ad alcune specie chimiche consumate o create. Proprio come con gli altri metodi, NMR può essere utilizzato per studiare le reazioni enzimatiche in funzione della temperatura, pH, o altre condizioni di soluzione, e gli effetti degli inibitori possono essere determinati.

Più recentemente, sono stati dimostrati i saggi di attività enzimatica basati su NMR per lo screening dei frammenti^3,4. I saggi basati su NMR sono ideali per lavorare alle concentrazioni più elevate di composti di prova (spesso fino a 1 mM) necessari per rilevare questi inibitori più deboli. La gamma dinamica e la dispersione dei turni chimici nell’esperimento NMR possono facilmente risolvere le risonanze da substrati, prodotti e composti di prova. Questo si confronta favorevolmente con i saggi spettrofotometrici in cui i problemi di interferenza di lettura spesso derivano da composti con profili di assorbimento UV-vis sovrapposti. Inoltre, poiché mancano di enzimi reporterschi, i test NMR a singolo enzima non sono inclini a falsi positivi accoppiati. Questo vantaggio li rende utili come saggi ortogonali, completando i tradizionali saggi di screening ad alta velocità e i saggi di triage da banco⁵.

Nel nostro laboratorio di ricerca, i saggi di attività basati su NMR vengono utilizzati per identificare e valutare gli inibitori di Trichomonas vaginalis nucleoside riboidrolasi. Il parassita T. vaginalis causa la malattia sessualmente trasmissibile non virale più diffusa⁶. La crescente resistenza alle terapie esistenti⁷ sta guidando la necessità di nuovi trattamenti basati su meccanismi, con enzimi essenziali del percorso di recupero nucleoside che rappresentano gli obiettivi principali⁸. Sono stati sviluppati saggi sull’attività NMR sia per gli enzimi specifici per la pirimidina che per la purina, per il riboidrolasi del nucleoto uridino (UNH)⁹e per l’adenosina/guanosina che preferiscono il riboidrolasi nucleoside (AGNH)¹⁰. Le reazioni catalizzate da questi due enzimi sono mostrate nella Figura 1. I saggi NMR vengono utilizzati per vagliare le librerie di frammenti per i punti di partenza chimici, determinare i valori IC₅₀ e eserbare gli inibitori di legame basati sull’aggregazione o covalenti¹¹. Gli stessi saggi vengono anche tradotti per valutare l’attività degli enzimi in intere cellule¹².

Sono previsti protocolli dettagliati per i saggi composti iniziali a 500 m e 250 m, i saggi di risposta alla dose per determinare i valori IC_50, i saggi dello schermo del controschermo del detergente, i saggi del controschermo jump-dilution e i saggi in E. coli intere cellule. I protocolli sono generalmente applicabili a qualsiasi enzima in cui il substrato e le risonanze dei prodotti possono essere osservati e distinti dalla spettroscopia NMR. Sono state fatte tre ipotesi per semplicità. In primo luogo, il substrato non è specificato. Affinché i saggi di attività basati su NMR siano utili, la concentrazione finale del substrato non dovrebbe essere superiore a 2-3 volte il valore K_m ⁴. Negli esempi mostrati, le concentrazioni finali di adenosina e 5-fluorouridina sono rispettivamente 100 M (K_m ) e 50 M (K_m – 15 M ). Nei protocolli, il raggiungimento di queste concentrazioni corrisponde a 12 – L di 5 mM di adenosina o 12 L di 2,5 mM 5-fluorouridina.

In secondo luogo, è stata scelta la quantità di enzimi prevista nei protocolli, 5 L, per corrispondere alla quantità necessaria per ottenere circa il 75% di conversione del substrato in prodotto in 30 min. Questa quantità rappresenta in genere una grande diluizione da uno stock di enzimi purificato e la diluizione deve essere determinata in anticipo per ogni enzima. Le soluzioni di stock di enzimi Purificate AGNH e UNH sono immagazzinate a -80 gradi centigradi in aliquote che forniscono un enzima sufficiente per diverse migliaia di reazioni. Pertanto, il fattore di diluizione idealmente deve essere determinato o convalidato solo ogni pochi mesi. In terzo luogo, l’esperimento NMR 1D specifico non è specificato. Nei risultati rappresentativi, ¹H NMR è indicato per AGNH¹⁰ e ¹⁹F NMR è indicato per UNH⁹, con l’esperimento NMR descritto nei riferimenti corrispondenti. La scelta dell’esperimento NMR dipende dalla reazione enzimatica e dai substrati disponibili, nonché dalla strumentazione NMR disponibile. Infine, va sottolineato che l’approccio sperimentale descritto non aderisce ai severi requisiti del NMR quantitativo (qNMR)^13,14. Nel protocollo, una reazione percentuale viene determinata utilizzando i cambiamenti relativi di intensità della stessa risonanza in ogni spettro, piuttosto che determinando le concentrazioni assolute. Questo approccio elimina la necessità di modifiche di acquisizione ed elaborazione dei dati, nonché gli standard interni o esterni, necessari per qNMR.