化合物阻害、IC50値、アーティフィファクト活性、ヌクレオシドリボヒドロラーゼの全細胞活性を決定するためのNMRベース活性アッセイ
Summary
NMRベースの活性アッセイは、2つのヌクレオシドリボヒドロラーゼ酵素の阻害剤を同定し、特徴付けるために開発された。プロトコルは、500 μMおよび250 μMの初期化合物アッセイ、IC50値を決定するための用量応答アッセイ、洗剤カウンタースクリーンアッセイ、ジャンプ希釈カウンタースクリーンアッセイ、および大腸菌全細胞のアッセイのために提供されます。
Abstract
NMR分光法は、創薬における酵素阻害剤の同定および特徴付けにしばしば用いられ、特に断片スクリーニングの文脈において使用される。NMRベースの活性アッセイは、これらの弱い阻害剤を検出するために必要なより高濃度の試験化合物で働くのに理想的に適しています。NMR実験におけるダイナミックレンジと化学シフト分散により、基板、製品、試験化合物からの共振を容易に解決できます。これは、UV-vis吸収プロファイルが重複する化合物から読み出し干渉の問題がしばしば生じる分光光測定アッセイとは対照的です。また、レポーター酵素が不足しているため、単酵素NMRアッセイは結合アッセイ偽陽性を起こしにくい。この属性は、従来の高スループットスクリーニングアッセイおよびベンチトップトリアージアッセイを補完する直交アッセイとして有用になります。詳細なプロトコルは、500 μMおよび250 μMの初期化合物アッセイ、IC50値を決定するための用量応答アッセイ、洗剤カウンタースクリーンアッセイ、ジャンプ希釈カウンタースクリーンアッセイ、および大腸菌全細胞におけるアッセイのために提供されます。これらの方法は、2つのヌクレオシドリボヒドロラーゼ酵素を用いて実証される。プリン特異的酵素に対して1H NMRの使用が示され、19F NMRはピリミジン特異的酵素に対して示されている。 プロトコルは、一般に、基質と製品の共鳴がNMR分光法によって観察および区別される任意の酵素に適用可能である。創薬の文脈で最も有用になるために、基板の最終的な濃度は、そのKm値の2〜3倍以下でなければなりません。 NMR実験の選択は、利用可能な酵素反応と基板、ならびに利用可能なNMR計測に依存する。
Introduction
核磁気共鳴(NMR)分光法は、酵素反応1、2を特徴付けおよび監視するために十分に確立されている。化学シフトと結合パターンの違いは、基板と製品の共振を区別するために使用され、相対共振強度は反応のパーセントを定量化するために使用されます。基板の消費と製品の作成の両方がNMRスペクトルで直接観察されます。これは分光光法または蛍光分光法とは対照的であり、反応時間の経過は、消費または作成されるいくつかの化学種に起因する吸光度の変化によって示される。他の方法と同様に、NMRは、温度、pH、または他の溶液条件の関数として酵素反応を研究するために使用することができ、阻害剤の効果を決定することができます。
さらに最近では、NMRベースの酵素活性アッセイは、フラグメントスクリーニング3、4について実証されている。NMRベースのアッセイは、これらの弱い阻害剤を検出するために必要な高濃度の試験化合物(多くの場合、1mMと同じくらい高い)で働くのに理想的に適しています。NMR実験におけるダイナミックレンジと化学シフト分散により、基板、製品、試験化合物からの共振を容易に解決できます。これは、読み出し干渉の問題が多くUV-vis吸収プロファイルが重複する化合物から生じる分光光アッセイと比較します。また、レポーター酵素が不足しているため、単酵素NMRアッセイは結合アッセイ偽陽性を起こしにくい。この利点は、それらが直交アッセイとして有用になり、従来の高スループットスクリーニングアッセイおよびベンチトップトリアージアッセイ5を補完する。
当研究室では、NMRベースの活性アッセイを用いて、トリコモナス膣ヌクレオシドリボヒドロラーゼの阻害剤を同定し、評価しています。T.膣寄生虫は、最も一般的な非ウイルス性感染症6を引き起こす。既存の治療法7に対する耐性の増加は、主要な標的8を表す必須ヌクレオシドサルベージ経路酵素を有する新規なメカニズムベースの治療の必要性を促進している。NMRベースの活性アッセイは、ピリミジンおよびプリン特異的酵素、ウリジンヌクレオシドリボヒドロラーゼ(UNH)9、およびアデノシン/グアノシンがヌクレオシドリボヒドロラーゼ(AGNH)10を好む両方のために開発された。これら2つの酵素によって触媒された反応を図1に示す。NMRアッセイは、化学的開始点のフラグメントライブラリをスクリーニングし、IC50値を決定し、集約ベースまたは共生結合阻害剤11を除離するために使用されている。同じアッセイはまた、全細胞12における酵素活性を評価するために翻訳されている。
詳細なプロトコルは、500 μMおよび250 μMの初期化合物アッセイ、IC50値を決定するための用量応答アッセイ、洗剤カウンタースクリーンアッセイ、ジャンプ希釈カウンタースクリーンアッセイ、および大腸菌全細胞におけるアッセイのために提供されます。プロトコルは、一般に、基質と製品の共鳴がNMR分光法によって観察および区別される任意の酵素に適用可能である。わかりやすくするために、3 つの仮定がなされています。まず、基板は指定されません。NMRベースの活性アッセイが有用である場合、基板の最終濃度はKm値4の2〜3倍以下であるべきである。示されている実施例では、アデノシンおよび5-フルオロリジンの最終濃度はそれぞれ100μM(K m= 54 μM)および50 μM(Km = 15 μM)である。プロトコルでは、これらの濃度を達成することは、5mMアデノシンの12 μLまたは2.5mM 5-フルオロリジンの12 μLに相当する。
第2に、プロトコルに提供される酵素の量は、5μL、30分で基板から製品への約75%の変換をもたらすのに必要な量に対応するように選択した。この量は、通常、精製酵素ストックからの大きな希釈を表し、希釈は、各酵素のために事前に決定する必要があります。精製されたAGNHおよびUNH酵素ストック溶液は、数千の反応に十分な酵素を提供するアリコートで-80°Cで保存されます。したがって、希釈係数は、理想的には数ヶ月ごとに決定または検証する必要があります。第3に、特定の1D NMR実験は指定されていない。代表的な結果では、AGNH10および19 F NMRに対して1H NMRが示され、対応する参考文献に記載されたNMR実験が示されている。 NMR実験の選択は、利用可能な酵素反応と基板、ならびに利用可能なNMR計測に依存する。最後に、記載された実験アプローチが定量的NMR(qNMR)13,14の厳密な要件に従わないことを指摘すべきである。プロトコルでは、パーセント反応は、絶対濃度を決定するのではなく、各スペクトルにおける同じ共振の強度の相対的な変化を使用して決定される。このアプローチにより、qNMRに必要な内部規格や外部規格と同様に、データの取得と処理の変更が不要になります。
Protocol
Representative Results
Discussion
記載されているプロトコルは、基質および/または製品がNMRスペクトル内で解決可能なシグナルを有することを条件として、一般に多くの酵素に適用可能である。しかし、基板の濃度がKm値に近く、合理的な時間枠内のNMR実験で検出されるほど高いことがわかります。2-3倍以下の基板濃度Km値は、競争力のある非競争的、競争力のない阻害剤4を検…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
アストラゼネカフラグメントライブラリーから化合物を提供してくれたディーン・ブラウン博士と、AGNHとUNH酵素を提供してくれたデビッド・パーキン博士に感謝します。この出版物で報告された研究は、B.J.S.に賞番号R15AI128585の下で国立衛生研究所のアレルギーと感染症の国立研究所によってサポートされました。内容は著者の責任のみであり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を表すものではなく、ランデスバーグ家であるS.N.M.に授与されたホレイス・G・マクドネル・サマー・リサーチ・フェローシップによっても支持された。フェローシップは、J.A.G.、およびアデルフィ大学からB.J.S.に対する教員開発助成金とフレデリック・ベッテルハイム研究賞を授与されました。
Materials
| AGNH | Purified in-house | N/A | TVAG_213720 |
| UNH | Purified in-house | N/A | TVAG_092730 |
| Adenosine | Sigma | A9251 | |
| 5-Fluorouridine | Sigma | F5130 | |
| Dimethyl sulfoxide-D6 | Cambridge Isotope Labs | DLM-10-100 | D, 99.9% |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P0662 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma | P3786 | |
| Potassium chloride | Sigma | P9541 | |
| Deuterium oxide | Cambridge Isotope Labs | DLM-4-100 | D, 99.9% |
| Hydrochloric acid | Fisher Chemical | A144212 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| 3-(Trimethylsilyl)propionic-2,2,3,3,-d4 acid sodium salt (TSP) | Sigma | 269913 | D, 98% |
| 2,2,2-Trifluoroethanol-1,1-d2 | Sigma | 612197 | D, 99.5% |
| Pipette | Gilson | F123602 | PIPETMAN Classic P1000 |
| Pipette | Gilson | F123601 | PIPETMAN Classic P200 |
| Pipette | Gilson | F123600 | PIPETMAN Classic P20 |
| Microfuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Conical tubes | Corning | 352099 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5418 | |
| Vortex mixer | Fisher Scientific | 02215365 | |
| NMR tubes | Norell | 502-7 | Or as appropriate for the NMR |
| NMR spectrometer | Bruker | N/A | AvanceIII500 |
| Prism software | GraphPad | N/A | Version 5.04 |
References
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