I protokollet presenteras omprogrammering av perifera mononukleära blodceller för att inducera neurala stamceller av Sendai virusinfektion, differentiering av iNSCs i dopaminerga neuroner, transplantation av DA-prekursorer till den ensidigt-lesioned Musmodeller för Parkinsons sjukdom och utvärdering av säkerheten och effekten av de iNSC-härledda DA-prekursorer för PD-behandling.
Parkinsons sjukdom (PD) orsakas av degeneration av dopaminerga (DA) nervceller vid substantia nigra pars compacta (SNpc) i den ventrala mesencephalon (VM). Cell substitutionsterapi har ett stort löfte för behandling av PD. nyligen har inducerad neurala stamceller (iNSCs) vuxit fram som en potentiell kandidat för cell substitutionsterapi på grund av minskad risk för tumör bildning och plasticitet att ge upphov till regionspecifika nervceller och glia. iNSCs kan omprogrammeras från autolodiga somatiska cellulära källor, såsom fibroblaster, perifera mononukleära blodceller (PBMNCs) och olika andra typer av celler. Jämfört med andra typer av somatiska celler, PBMNCs är en tilltalande förrätt celltyp på grund av den lätthet att komma åt och expandera i kulturen. Sendai virus (SeV), en RNA icke-integrativ virus, kodning omprogrammering faktorer inklusive Human OCT3/4, SOX2, KLF4 och c-MYC, har en negativ känsla, enkelsträngad, icke-segmenterade genomet som inte integreras i värd arvsmassa, men bara replikat i cytoplasman hos infekterade celler, som erbjuder ett effektivt och säkert fordon för omprogrammering. I den här studien beskriver vi ett protokoll där iNSCs erhålls genom omprogrammering av PBMNCs, och differentieras till specialiserade VM DA-neuroner genom en tvåstegs metod. Sedan DA prekursorer transplanteras in ensidigt 6-hyroxydopamin (6-OHDA)-lesioned PD musmodeller för att utvärdera säkerhet och effekt för behandling av PD. Denna metod ger en plattform för att undersöka de funktioner och terapeutiska effekterna av patientspecifika DA neurala celler in vitro-och in vivo.
Parkinsons sjukdom (PD) är en vanlig neurodegenerativ sjukdom, orsakad av degeneration av dopaminerga (DA) nervceller vid substantia nigra pars compacta (SNpc) i ventrala mesencephalon (VM), med en prevalens av mer än 1% i befolkningen över 60 års ålder 1 , 2. under det senaste decenniet, cellterapi, som syftar till att antingen ersätta de degenerativa eller skadade celler, eller näring mikromiljön runt degenererade neuroner, har visat potential i behandling av PD3. Samtidigt har omprogrammeringsteknik gjort betydande framsteg4, vilket ger en lovande cellulär källa för substitutionsterapi. Humana inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) och embryonala stamceller (ESCs) har visat sig kunna differentiera till DA neurala celler, som kan överleva, mognad, och förbättra motoriska funktioner när ympas till råtta och icke-mänskliga primater PD-modeller5 ,6,7,8. iPSCs utgör en milstolpe i cellulära omprogrammeringstekniker och har en stor potential vid celltransplantation. emellertid, det finns fortfarande en oro över risken för tumör bildning från ofullständigt differentierade celler. En alternativ cellulär källa för celltransplantation är härstamning-engagerade adulta stamceller erhållna genom direkt omprogrammering, såsom inducerade neurala stamceller (iNSCs), som kan härledas från de instabila intermediaterna, som förbigår pluripotensen etapp9,10,11.
Både iPSCs och inscs kan omprogrammeras från autolodiga cellulära källor, såsom fibroblaster, perifera mononukleära blodceller (pbmncs) och olika andra typer av celler12,13,14, vilket minskar Immunogenicitet av transplanterade celler i hög grad. Dessutom, jämfört med iPSCs, iNSCs är inneboende med minskad risk för tumör bildning och härstamning-engagerade plasticitet, endast kunna differentiera till nervceller och glia11. I de första studierna, mänskliga eller mus iPSCs och inscs genererades från fibroblaster erhållits från hudbiopsier, vilket är ett invasivt förfarande14,15. Med detta avseende, PBMNCs är en tilltalande förrätt cell källa på grund av den mindre invasiva provtagning processen, och lätt att få ett stort antal celler inom en kort period av expansionstid16. Inledande omprogrammering studier anställda integrativ leveranssystem, såsom lentivirala eller retrovirala vektorer, som är effektiva och lätta att genomföra i många typer av celler17; dessa leveranssystem kan dock orsaka mutationer och reaktivering av kvarvarande transgener, som utgör säkerhetsfrågor för kliniska terapeutiska ändamål12. Sendai virus (SeV) är en icke-integrativ RNA-virus med en negativ känsla, enkelsträngad arvsmassa som inte integreras i värd arvsmassan, men bara replikat i cytoplasman hos infekterade celler, som erbjuder ett effektivt och säkert fordon för omprogrammering18 ,19. Rekombinanta SeV vektorer finns tillgängliga som innehåller omprogrammering faktorer inklusive Human OCT3/4, SOX2, KLF4 och c-MYC i sina öppna Läs ramar. Dessutom kan SeV virusvektorer förbättras ytterligare genom att införa temperaturkänsliga mutationer, så att de snabbt kan avlägsnas när odlings temperaturen höjs till 39 ° c20. I den här artikeln beskriver vi ett protokoll för att programmera PBMNCs till iNSCs med hjälp av SeV-systemet.
Många studier har rapporterat härledning av da neuroner från mänskliga ESCs eller iPSCs med hjälp av olika metoder6,8,21. Emellertid, det finns en brist på protokoll som beskriver differentiering av DA neuroner från iNSCs i detaljer. I detta protokoll kommer vi att beskriva den effektiva generationen av DA-neuroner från iNSCs med hjälp av en tvåstegs metod. DA neuronala prekursorer kan transplanteras in i striatum av PD musmodeller för säkerhet och effekt utvärderingar. Denna artikel kommer att presentera ett detaljerat protokoll som täcker olika stadier från generering av inducerad neurala stamceller av Sendai virus, differentiering av iNSCs i DA neuroner, inrättande av mus PD-modeller, till transplantation av DA prekursorer i striatum av PD-modellerna. Med hjälp av detta protokoll kan man generera iNSCs från patienter och friska donatorer och härleda DA neuroner som är säkra, standardiserade, skalbara och homogena för celltransplantation ändamål, eller för modellering PD i en maträtt och utredning av mekanismerna bakomliggande sjukdomsdebut och utveckling.
Här presenterade vi ett protokoll som täckte olika stadier av iNSC-DA cellterapi för PD-modeller. Kritiska aspekter av detta protokoll inkluderar: (1) isolering och expansion av PBMNCs och omprogrammering av PBMNCs till iNSCs av SeV infektion, (2) differentiering av iNSCs till DA neuroner, (3) inrättande av ensidiga 6-OHDA-lesioned PD musmodeller och beteendemässiga bedömning och (4) celltransplantation av DA-prekursorer och beteendemässig bedömning.
I detta protokoll, den första dele…
The authors have nothing to disclose.
Arbetet stöddes av följande bidrag: stamcells-och översättnings nationella nyckelprojekt (2016YFA0101403), Kinas National Natural Science Foundation (81661130160, 81422014, 81561138004), Beijing Municipal Natural Science Foundation (5142005), Peking Talents Foundation (2017000021223TD03), stödprojekt av hög nivå lärare i Peking kommunala universitet under perioden 13: e fem års plan (CIT & TCD20180333), Peking Medical system hög nivå Talent Award (2015-3-063), Peking Kommunal Health Commission Fund (PXM 2018_026283_000002), Peking 100, Thousand, och 10000 talanger Fund (2018A03), Beijing kommunal administration av sjukhus klinisk medicin utveckling av särskilda finansieringsstöd (ZYLX201706), och Royal Society-Newton avancerad gemenskap (NA150482).
15-ml conical tube | Corning | 430052 | |
1-Thioglycerol | Sigma-Aldrich | M6145 | Toxic for inhalation and skin contact |
24-well plate | Corning | 3337 | |
50-ml conical tube | Corning | 430828 | |
6-OHDA | Sigma-Aldrich | H4381 | |
6-well plate | Corning | 3516 | |
Accutase | Invitrogen | A11105-01 | Cell dissociation reagent |
Apomorphine | Sigma-Aldrich | A4393 | |
Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A92902 | Toxic with skin contact |
B27 supplement | Invitrogen | 17504044 | |
BDNF | Peprotech | 450-02 | Brain derived neurotrophic factor |
Blood collection tubes containing sodium heparin | BD | 367871 | |
BSA | yisheng | 36106es60 | Fetal bovine serum |
cAMP | Sigma-Aldrich | D0627 | Dibutyryladenosine cyclic monophosphate |
CellBanker 2 | ZENOAQ | 100ml | Used as freezing medium for PBMNCs |
Chemically defined lipid concentrate | Invitrogen | 11905031 | |
CHIR99021 | Gene Operation | 04-0004 | |
Coverslip | Fisher | 25*25-2 | |
DAPI | Sigma-Aldrich | D8417-10mg | |
DAPT | Sigma-Aldrich | D5942 | |
Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D2915-100MG | |
DMEM-F12 | Gibco | 11330 | |
DMEM-F12 | Gibco | 11320 | |
Donkey serum | Jackson | 017-000-121 | |
EPO | Peprotech | 100-64-50UG | Human Erythropoietin |
FGF8b | Peprotech | 100-25 | |
Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare | 17-5442-02 | P=1.077, density gradient medium |
GDNF | Peprotech | 450-10 | Glial derived neurotrophic factor |
GlutaMAX | Invitrogen | 21051024 | 100 × Glutamine stock solution |
Ham's-F12 | Gibco | 11765-054 | |
HBSS | Invitrogen | 14175079 | Balanced salt solution |
Human leukemia inhibitory factor | Millpore | LIF1010 | |
Human recombinant SCF | Peprotech | 300-07-100UG | |
IGF-1 | Peprotech | 100-11-100UG | Human insulin-like growth factor |
IL-3 | Peprotech | 200-03-10UG | Human interleukin 3 |
IMDM | Gibco | 215056-023 | Iscove's modified Dulbecco's medium |
Insulin | Roche | 12585014 | |
ITS-X | Invitrogen | 51500-056 | Insulin-transferrin-selenium-X supplement |
Knockout serum replacement | Gibco | 10828028 | Serum free basal medium |
Laminin | Roche | 11243217001 | |
Microsyringe | Hamilton | 7653-01 | |
N2 supplement | Invitrogen | 17502048 | |
NEAA | Invitrogen | 11140050 | Non-essential amino acid |
Neurobasal | Gibco | 10888 | Basic medium |
PDL | Sigma-Aldrich | P7280 | Poly-D-lysine |
SAG1 | Enzo | ALX-270-426-M01 | |
SB431542 | Gene Operation | 04-0010-10mg | Store from light at -20℃ |
Sendai virus | Life Technologies | MAN0009378 | |
Sucrose | baiaoshengke | ||
TGFβⅢ | Peprotech | 100-36E | Transforming growth factor βⅢ |
Transferrin | R&D Systems | 2914-HT-100G | |
Triton X 100 | baiaoshengke | Nonionic surfactant | |
Trypan blue | Gibco | T10282 | |
Xylazine | Sigma-Aldrich | X1126 |