Summary

Generierung induzierter neuronaler Stammzellen aus peripheren mononukleären Zellen und Differenzierung zu dopaminergen Neuronenvorstufen für Transplantationsstudien

Published: July 11, 2019
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Summary

Das Protokoll stellt die Reprogrammierung von peripheren mononukleären Blutzellen vor, um neuronale Stammzellen durch Sendai-Virusinfektion zu induzieren, Differenzierung von iNSCs in dopaminerge Neuronen, Transplantation von DA-Vorstufen in die einseitig Parkinson-Mausmodelle und Bewertung der Sicherheit und Wirksamkeit von iNSC-abgeleiteten DA-Vorstufen für die PD-Behandlung.

Abstract

Die Parkinson-Krankheit (PD) wird durch Degeneration von dopaminergen (DA) Neuronen an der Substantia nigra pars compacta (SNpc) im ventralen Mesencephalon (VM) verursacht. Zellersatztherapie hält große Versprechen für die Behandlung von PD. In letzter Zeit haben sich induzierte neuronale Stammzellen (iNSCs) als potenzieller Kandidat für die Zellersatztherapie aufgrund des reduzierten Risikos der Tumorbildung und der Plastizität, die zu regionsspezifische Neuronen und Glia. iNSCs können aus autologen somatischen Zellquellen wie Fibroblasten, peripheren mononukleären Blutzellen (PBMNCs) und verschiedenen anderen Zelltypen umprogrammiert werden. Im Vergleich zu anderen Arten von somatischen Zellen sind PBMNCs ein attraktiver Starterzellentyp, da der Zugriff auf die Kultur erleichtert und erweitert wird. Sendai Virus (SeV), ein nichtintegratives RNA-Virus, das Reprogramming-Faktoren wie humanoct3/4, SOX2, KLF4 und c-MYC kodiert, hat ein negativ-sinnliches, einsträngiges, nicht segmentiertes Genom, das sich nicht in Wirtsgenom, sondern nur im Zytoplasma infizierter Zellen repliziert, bietet ein effizientes und sicheres Vehikel für die Neuprogrammierung. In dieser Studie beschreiben wir ein Protokoll, in dem iNSCs durch Neuprogrammierung von PBMNCs erhalten und durch eine zweistufige Methode in spezialisierte VM-DA-Neuronen differenziert werden. Dann werden DA-Vorläufer in einseitig 6-Hyroxydopamin (6-OHDA)-lsioned PD-Mausmodelle transplantiert, um die Sicherheit und Wirksamkeit für die Behandlung von PD zu bewerten. Diese Methode bietet eine Plattform, um die Funktionen und therapeutischen Wirkungen patientenspezifischer DA-Neuralzellen in vitro und in vivo zu untersuchen.

Introduction

Parkinson-Krankheit (PD) ist eine häufige neurodegenerative Erkrankung, verursacht durch Degeneration von dopaminergen (DA) Neuronen an der Substantia nigra pars compacta (SNpc) im ventralen Mesencephalon (VM), mit einer Prävalenz von mehr als 1% in der Bevölkerung über 60 Jahre alt 1 , 2. In den letzten zehn Jahren hat die Zelltherapie, die darauf abzielt, entweder die degenerativen oder geschädigten Zellen zu ersetzen oder die Mikroumgebung um die degenerierenden Neuronen zu nähren, Potenzial bei der Behandlung von PD3gezeigt. Inzwischen hat die Umprogrammierungstechnologie signifikante Fortschritte gemacht4, die eine vielversprechende zelluläre Quelle für die Ersatztherapie bietet. Es hat sich gezeigt, dass sich humaninduzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs) und embryonale Stammzellen (ESCs) in DA-Neuralzellen differenzieren können, die überleben, reifen und die motorischen Funktionen verbessern könnten, wenn sie in Ratten- und nichtmenschliche Primaten-PD-Modelle eingepfropft werden5 ,6,7,8. iPSCs stellen einen Meilenstein in der zellulären Reprogrammierungstechnologie dar und haben ein großes Potenzial in der Zelltransplantation; Es besteht jedoch nach wie vor Bedenken hinsichtlich des Risikos einer Tumorbildung durch die unvollständig differenzierten Zellen. Eine alternative zelluläre Quelle für die Zelltransplantation sind abstammungsgebundene adulte Stammzellen, die durch direkte Reprogrammierung gewonnen werden, wie z. B. induzierte neuronale Stammzellen (iNSCs), die aus den instabilen Zwischenprodukten abgeleitet werden können, um die Pluripotenz zu umgehen. Stufe9,10,11.

Sowohl iPSCs als auch iNSCs können aus autologen Zellquellen wie Fibroblasten, peripheren mononukleären Blutzellen (PBMNCs) und verschiedenen anderen Zelltypen12,13,14umprogrammiert werden, wodurch die Immunogenität transplantierter Zellen in hohem Maße. Darüber hinaus sind iNSCs im Vergleich zu iPSCs mit einem reduzierten Risiko für Tumorbildung und liniengebundene Plastizität verbunden, die nur in der Lage sind, sich in Neuronen und Glia zu differenzieren11. In den ersten Studien wurden humane oder Maus-iPSCs und iNSCs aus Fibroblasten aus Hautbiopsien gewonnen, was ein invasives Verfahrenist 14,15. In diesem Zusammenhang sind PBMNCs eine ansprechende Starterzellquelle aufgrund des weniger invasiven Probenahmeprozesses und der Leichtigkeit, eine große Anzahl von Zellen innerhalb einer kurzen Expansionszeit zu erhalten16. Erste Reprogrammierungsstudien verwendeten integrative Abgabesysteme, wie z. B. lentivirale oder retrovirale Vektoren, die in vielen Zelltypen effizient und einfach umzusetzen sind17; diese Abgabesysteme können jedoch Mutationen und Reaktivierung endenvon Resttransgenen, die Sicherheitsprobleme für klinische therapeutische Zwecke darstellen12. Sendai-Virus (SeV) ist ein nicht-integratives RNA-Virus mit einem negativ-sinnlichen, einsträngigen Genom, das sich nicht in das Wirtsgenom integriert, sondern sich nur im Zytoplasma infizierter Zellen repliziert und ein effizientes und sicheres Vehikel für die Neuprogrammierung bietet18 ,19. Rekombinante SeV-Vektoren sind verfügbar, die Reprogrammierungsfaktoren wie menschliche OCT3/4, SOX2, KLF4 und c-MYC in ihren offenen Leserahmen enthalten. Darüber hinaus können SeV-Virusvektoren durch die Einführung temperaturempfindlicher Mutationen weiter verbessert werden, so dass sie schnell entfernt werden können, wenn die Kulturtemperatur auf 39 °C20angehoben wird. In diesem Artikel beschreiben wir ein Protokoll zum Umprogrammieren von PBMNCs auf iNSCs mithilfe des SeV-Systems.

Viele Studien haben die Ableitung von DA-Neuronen von menschlichen ESCs oder iPSCs mit verschiedenen Methoden6,8,21berichtet. Es gibt jedoch einen Mangel an Protokollen, die die Differenzierung von DA-Neuronen von iNSCs im Detail beschreiben. In diesem Protokoll beschreiben wir die effiziente Generierung von DA-Neuronen von iNSCs mit einer zweistufigen Methode. Die da neuronalen Vorläufer können zur Sicherheit und Wirksamkeit in das Striatum von PD-Mausmodellen transplantiert werden. Dieser Artikel wird ein detailliertes Protokoll vorstellen, das verschiedene Stadien von der Generierung induzierter neuronaler Stammzellen durch Sendai-Virus, der Differenzierung von iNSCs in DA-Neuronen, der Etablierung von Maus-PD-Modellen bis hin zur Transplantation von DA-Vorläufern in das Striatum abdeckt. der PD-Modelle. Mit diesem Protokoll kann man iNSCs von Patienten und gesunden Spendern generieren und DA-Neuronen ableiten, die sicher, standardisierbar, skalierbar und homogen für Zelltransplantationszwecke sind, oder zur Modellierung von PD in einer Schale und zur Untersuchung der Mechanismen Grunderkrankungsbeginn und -entwicklung.

Protocol

Alle Verfahren müssen den Leitlinien der Ethikkommission für die institutionelle Menschliche Forschung folgen. Vor der Blutentnahme muss die informierte Zustimmung von Patienten oder gesunden Probanden eingeholt werden. Dieses Protokoll wurde von der Ethikkommission für Humanforschung der Institution genehmigt und gemäß den Richtlinien der Institution für die Pflege und Verwendung von Tieren durchgeführt. 1. Sammlung, Isolierung und Erweiterung von PBMNCs Sammlung von …

Representative Results

Hier berichten wir über ein Protokoll, das verschiedene Stadien der iNSC-DA-Zelltherapie zur Behandlung von PD-Modellen abdeckt. Erstens wurden PBMNCs isoliert und erweitert und durch SeV-Infektion in iNSCs umprogrammiert. Eine schematische Darstellung der Prozeduren mit PBMNC-Erweiterung und iNSC-Induktion ist in Abbildung 1dargestellt. Am Tag -14 wurden PBMNCs mit einem Dichtegradientenmedium (Materialtabelle )isoliert. Vor der Zentrifugation wurden mit PBS und dem Dichte…

Discussion

Hier präsentierten wir ein Protokoll, das verschiedene Stadien der iNSC-DA-Zelltherapie für PD-Modelle abdeckte. Zu den kritischen Aspekten dieses Protokolls gehören: (1) Isolierung und Erweiterung von PBMNCs und Umprogrammierung von PBMNCs in iNSCs durch SeV-Infektion, (2) Differenzierung von iNSCs zu DA-Neuronen, (3) Etablierung einseitiger 6-OHDA-verleumderter PD-Mausmodelle und Verhaltens- und (4) Zelltransplantation von DA-Vorstufen und Verhaltensbeurteilung.

In diesem Protokoll umfass…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Arbeit wurde durch folgende Stipendien unterstützt: Stem Cell and Translation National Key Project (2016YFA0101403), National Natural Science Foundation of China (81661130160, 81422014, 81561138004), Municipal Beijing Natural Science Foundation (5142005), Beijing Talents Foundation (2017000021223TD03), Support Project of High-Level Teachers in Beijing Municipal Universities in the period of 13th Five-year Plan (CIT & TCD20180333), Beijing Medical System High Level Talent Award (2015-3-063), Beijing Municipal Health Commission Fund (PXM 2018_026283_000002), Beijing One Hundred, Thousand, and Ten Thousand Talents Fund (2018A03), Beijing Municipal Administration of Hospitals Clinical Medicine Development of Special Funding Support (ZYLX201706) Royal Society-Newton Advanced Fellowship (NA150482).

Materials

15-ml conical tube Corning 430052
1-Thioglycerol Sigma-Aldrich M6145 Toxic for inhalation and skin contact
24-well plate Corning 3337
50-ml conical tube  Corning 430828
6-OHDA Sigma-Aldrich H4381
6-well plate Corning 3516
Accutase Invitrogen A11105-01 Cell dissociation reagent
Apomorphine Sigma-Aldrich A4393
Ascorbic acid Sigma-Aldrich A92902 Toxic with skin contact 
B27 supplement  Invitrogen 17504044
BDNF Peprotech 450-02 Brain derived neurotrophic factor
Blood collection tubes containing sodium heparin BD 367871
BSA yisheng 36106es60 Fetal bovine serum
cAMP Sigma-Aldrich D0627 Dibutyryladenosine cyclic monophosphate
CellBanker 2 ZENOAQ 100ml Used as freezing medium for PBMNCs
Chemically defined lipid concentrate Invitrogen 11905031
CHIR99021 Gene Operation 04-0004
Coverslip Fisher 25*25-2
DAPI Sigma-Aldrich D8417-10mg
DAPT Sigma-Aldrich D5942
Dexamethasone Sigma-Aldrich D2915-100MG
DMEM-F12 Gibco 11330
DMEM-F12 Gibco 11320
Donkey serum Jackson 017-000-121
EPO Peprotech 100-64-50UG Human Erythropoietin
FGF8b Peprotech 100-25
Ficoll-Paque Premium GE Healthcare 17-5442-02 P=1.077, density gradient medium
GDNF Peprotech 450-10 Glial derived neurotrophic factor
GlutaMAX Invitrogen 21051024 100 × Glutamine stock solution
Ham's-F12 Gibco 11765-054
HBSS Invitrogen 14175079 Balanced salt solution
Human leukemia inhibitory factor Millpore LIF1010
Human recombinant SCF Peprotech 300-07-100UG
IGF-1 Peprotech 100-11-100UG Human insulin-like growth factor 
IL-3 Peprotech 200-03-10UG Human interleukin 3
IMDM Gibco 215056-023 Iscove's modified Dulbecco's medium
Insulin Roche  12585014
ITS-X Invitrogen 51500-056 Insulin-transferrin-selenium-X supplement
Knockout serum replacement Gibco 10828028 Serum free basal medium
Laminin Roche  11243217001
Microsyringe Hamilton 7653-01
N2 supplement  Invitrogen 17502048
NEAA Invitrogen 11140050 Non-essential amino acid
Neurobasal Gibco 10888 Basic medium
PDL Sigma-Aldrich P7280 Poly-D-lysine
SAG1 Enzo ALX-270-426-M01
SB431542 Gene Operation 04-0010-10mg Store from light at -20℃
Sendai virus Life Technologies MAN0009378
Sucrose baiaoshengke
TGFβⅢ Peprotech 100-36E Transforming growth factor  βⅢ
Transferrin R&D Systems 2914-HT-100G
Triton X 100 baiaoshengke Nonionic surfactant
Trypan blue Gibco T10282
Xylazine Sigma-Aldrich X1126

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Cite This Article
Zheng, W., Chen, Z. Generation of Induced Neural Stem Cells from Peripheral Mononuclear Cells and Differentiation Toward Dopaminergic Neuron Precursors for Transplantation Studies. J. Vis. Exp. (149), e59690, doi:10.3791/59690 (2019).

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