Generierung induzierter neuronaler Stammzellen aus peripheren mononukleären Zellen und Differenzierung zu dopaminergen Neuronenvorstufen für Transplantationsstudien

Parkinson-Krankheit (PD) ist eine häufige neurodegenerative Erkrankung, verursacht durch Degeneration von dopaminergen (DA) Neuronen an der Substantia nigra pars compacta (SNpc) im ventralen Mesencephalon (VM), mit einer Prävalenz von mehr als 1% in der Bevölkerung über 60 Jahre alt ^{1 , 2}. In den letzten zehn Jahren hat die Zelltherapie, die darauf abzielt, entweder die degenerativen oder geschädigten Zellen zu ersetzen oder die Mikroumgebung um die degenerierenden Neuronen zu nähren, Potenzial bei der Behandlung von PD³gezeigt. Inzwischen hat die Umprogrammierungstechnologie signifikante Fortschritte gemacht⁴, die eine vielversprechende zelluläre Quelle für die Ersatztherapie bietet. Es hat sich gezeigt, dass sich humaninduzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs) und embryonale Stammzellen (ESCs) in DA-Neuralzellen differenzieren können, die überleben, reifen und die motorischen Funktionen verbessern könnten, wenn sie in Ratten- und nichtmenschliche Primaten-PD-Modelle eingepfropft werden^{5 ,6,7,8}. iPSCs stellen einen Meilenstein in der zellulären Reprogrammierungstechnologie dar und haben ein großes Potenzial in der Zelltransplantation; Es besteht jedoch nach wie vor Bedenken hinsichtlich des Risikos einer Tumorbildung durch die unvollständig differenzierten Zellen. Eine alternative zelluläre Quelle für die Zelltransplantation sind abstammungsgebundene adulte Stammzellen, die durch direkte Reprogrammierung gewonnen werden, wie z. B. induzierte neuronale Stammzellen (iNSCs), die aus den instabilen Zwischenprodukten abgeleitet werden können, um die Pluripotenz zu umgehen. Stufe^9,10,11.

Sowohl iPSCs als auch iNSCs können aus autologen Zellquellen wie Fibroblasten, peripheren mononukleären Blutzellen (PBMNCs) und verschiedenen anderen Zelltypen^12,13,14umprogrammiert werden, wodurch die Immunogenität transplantierter Zellen in hohem Maße. Darüber hinaus sind iNSCs im Vergleich zu iPSCs mit einem reduzierten Risiko für Tumorbildung und liniengebundene Plastizität verbunden, die nur in der Lage sind, sich in Neuronen und Glia zu differenzieren¹¹. In den ersten Studien wurden humane oder Maus-iPSCs und iNSCs aus Fibroblasten aus Hautbiopsien gewonnen, was ein invasives Verfahren^{ist 14,15}. In diesem Zusammenhang sind PBMNCs eine ansprechende Starterzellquelle aufgrund des weniger invasiven Probenahmeprozesses und der Leichtigkeit, eine große Anzahl von Zellen innerhalb einer kurzen Expansionszeit zu erhalten¹⁶. Erste Reprogrammierungsstudien verwendeten integrative Abgabesysteme, wie z. B. lentivirale oder retrovirale Vektoren, die in vielen Zelltypen effizient und einfach umzusetzen sind¹⁷; diese Abgabesysteme können jedoch Mutationen und Reaktivierung endenvon Resttransgenen, die Sicherheitsprobleme für klinische therapeutische Zwecke darstellen¹². Sendai-Virus (SeV) ist ein nicht-integratives RNA-Virus mit einem negativ-sinnlichen, einsträngigen Genom, das sich nicht in das Wirtsgenom integriert, sondern sich nur im Zytoplasma infizierter Zellen repliziert und ein effizientes und sicheres Vehikel für die Neuprogrammierung bietet^{18 ,19}. Rekombinante SeV-Vektoren sind verfügbar, die Reprogrammierungsfaktoren wie menschliche OCT3/4, SOX2, KLF4 und c-MYC in ihren offenen Leserahmen enthalten. Darüber hinaus können SeV-Virusvektoren durch die Einführung temperaturempfindlicher Mutationen weiter verbessert werden, so dass sie schnell entfernt werden können, wenn die Kulturtemperatur auf 39 °C²⁰angehoben wird. In diesem Artikel beschreiben wir ein Protokoll zum Umprogrammieren von PBMNCs auf iNSCs mithilfe des SeV-Systems.

Viele Studien haben die Ableitung von DA-Neuronen von menschlichen ESCs oder iPSCs mit verschiedenen Methoden^6,8,21berichtet. Es gibt jedoch einen Mangel an Protokollen, die die Differenzierung von DA-Neuronen von iNSCs im Detail beschreiben. In diesem Protokoll beschreiben wir die effiziente Generierung von DA-Neuronen von iNSCs mit einer zweistufigen Methode. Die da neuronalen Vorläufer können zur Sicherheit und Wirksamkeit in das Striatum von PD-Mausmodellen transplantiert werden. Dieser Artikel wird ein detailliertes Protokoll vorstellen, das verschiedene Stadien von der Generierung induzierter neuronaler Stammzellen durch Sendai-Virus, der Differenzierung von iNSCs in DA-Neuronen, der Etablierung von Maus-PD-Modellen bis hin zur Transplantation von DA-Vorläufern in das Striatum abdeckt. der PD-Modelle. Mit diesem Protokoll kann man iNSCs von Patienten und gesunden Spendern generieren und DA-Neuronen ableiten, die sicher, standardisierbar, skalierbar und homogen für Zelltransplantationszwecke sind, oder zur Modellierung von PD in einer Schale und zur Untersuchung der Mechanismen Grunderkrankungsbeginn und -entwicklung.