Summary

Generación de células madre neuronales inducidas a partir de células mononucleares periféricas y diferenciación hacia precursores de neuronas dopaminérgicas para estudios de trasplante

Published: July 11, 2019
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Summary

El protocolo presenta la reprogramación de células mononucleares de sangre periférica para inducir células madre neurales por infección por el virus Sendai, diferenciación de iNSCs en neuronas dopaminérgicas, trasplante de precursores de DA en el unilateralmente-lesioned Modelos de ratón de la enfermedad de Parkinson, y evaluación de la seguridad y eficacia de los precursores de DA derivados de iNSC para el tratamiento de la DP.

Abstract

La enfermedad de Parkinson (PD) es causada por la degeneración de las neuronas dopaminérgicas (DA) en la sustancia nigra pars compacta (SNpc) en el mesencéfalo ventral (VM). La terapia de reemplazo celular tiene una gran promesa para el tratamiento de la DP. Recientemente, las células madre neurales inducidas (iNSC) han surgido como un candidato potencial para la terapia de reemplazo celular debido al menor riesgo de formación de tumores y la plasticidad para dar lugar a neuronas y glia específicas de la región. los iNSC se pueden reprogramar a partir de fuentes celulares somáticas autólogas, como fibroblastos, células mononucleares de sangre periférica (PMF) y varios otros tipos de células. En comparación con otros tipos de células somáticas, los PBMNAC son un tipo de celda de inicio atractivo debido a la facilidad de acceso y expansión en cultivo. El virus Sendai (SeV), un virus no integrador de ARN, que codifica factores de reprogramación como OCT3/4humano, SOX2, KLF4 y c-MYC, tiene un genoma no segmentado, de un solo cadena y de sentido negativo que no se integra en gento del huésped, pero sólo se replica en el citoplasma de las células infectadas, ofreciendo un vehículo eficiente y seguro para la reprogramación. En este estudio, describimos un protocolo en el que los iNSC se obtienen reprogramando PBX y diferenciados en neuronas DA de VM especializadas mediante un método de dos etapas. A continuación, los precursores de DA se trasplantan en modelos unilaterales de ratón PD de 6-hyroxydopamine (6-OHDA) para evaluar la seguridad y eficacia para el tratamiento de la DP. Este método proporciona una plataforma para investigar las funciones y efectos terapéuticos de las células neuronales DA específicas del paciente in vitro e in vivo.

Introduction

La enfermedad de Parkinson (PD) es un trastorno neurodegenerativo común, causado por la degeneración de las neuronas dopaminérgicas (DA) en la sustancia nigra pars compacta (SNpc) en el mesencéfalo ventral (VM), con una prevalencia de más del 1% en la población mayor de 60 años de edad 1 , 2. Durante la última década, la terapia celular, dirigida a sustituir las células degenerativas o dañadas, o nutrir el microambiente alrededor de las neuronas degenerativas, ha demostrado potencial en el tratamiento de la DP3. Mientras tanto, la tecnología de reprogramación ha hecho progresos significativos4, que proporciona una fuente celular prometedora para la terapia de reemplazo. Se ha demostrado que las células madre pluripotentes inducidas por el hombre (iPSC) y las células madre embrionarias (ESC) son capaces de diferenciarse en células neuronales DA, que podrían sobrevivir, madurar y mejorar las funciones motoras cuando se injertan en modelos de DP de rata y primate no humano5 ,6,7,8. los iPSC representan un hito en las tecnologías de reprogramación celular y tienen un gran potencial en el trasplante de células; sin embargo, todavía existe una preocupación sobre el riesgo de formación de tumores de las células incompletamente diferenciadas. Una fuente celular alternativa para el trasplante de células es la que las células madre adultas cometidas por linajes se obtienen a través de la reprogramación directa, como las células madre neurales inducidas (iNSC), que pueden derivarse de los intermediarios inestables, evitando la pluripotencia etapa9,10,11.

Tanto los ISPC como los iNSC pueden reprogramarse a partir de fuentes celulares autólogas, como fibroblastos, células mononucleares de sangre periférica (PBMNC) y varios otros tipos de células12,13,14,reduciendo así la inmunogenicidad de las células trasplantadas en gran medida. Además, en comparación con los iPSC, los iNSC son inherentes a la reducción del riesgo de formación de tumores y la plasticidad comprometida con el linaje, sólo capaces de diferenciarse en neuronas y glia11. En los estudios iniciales, se generaron iPSCs humanos o ratón e iNSC a partir de fibroblastos obtenidos a partir de biopsias cutáneas, que es un procedimiento invasivo14,15. Con este respecto, los PBMNC sson una fuente de células de inicio atractiva debido al proceso de muestreo menos invasivo, y la facilidad para obtener un gran número de células dentro de un corto período de tiempo de expansión16. Los estudios iniciales de reprogramación emplearon sistemas de administración integrador, como vectores lentivirales o retrovirales, que son eficientes y fáciles de implementar en muchos tipos de células17; sin embargo, estos sistemas de administración pueden causar mutaciones y reactivación de transgenes residuales, que presentan problemas de seguridad con fines terapéuticos clínicos12. El virus DeSendai (SeV) es un virus de ARN no integrador con un genoma de una sola cadena de sentido negativo que no se integra en el genoma del huésped, sino que sólo se replica en el citoplasma de las células infectadas, ofreciendo un vehículo eficiente y seguro para la reprogramación18 ,19. Hay disponibles vectores SeV recombinantes que contienen factores de reprogramación, incluidos los modelos humanos OCT3/4, SOX2, KLF4 y c-MYC en sus marcos de lectura abiertos. Además, los vectores virales SeV pueden mejorarse aún más mediante la introducción de mutaciones sensibles a la temperatura, de modo que podrían eliminarse rápidamente cuando la temperatura de cultivo se eleva a 39 oC20. En este artículo, se describe un protocolo para reprogramar PBX a iNSCs mediante el sistema SeV.

Muchos estudios han reportado derivación de neuronas DA de ESCs humanas o iPSC utilizando varios métodos6,8,21. Sin embargo, hay una escasez de protocolos que describen la diferenciación de las neuronas DA de iNSCs en detalle. En este protocolo, describiremos la generación eficiente de neuronas DA a partir de iNSCs utilizando un método de dos etapas. Los precursores neuronales DA se pueden trasplantar al estriado de los modelos de ratón PD para evaluaciones de seguridad y eficacia. Este artículo presentará un protocolo detallado que cubre varias etapas desde la generación de células madre neurales inducidas por el virus Sendai, diferenciación de iNSCs en neuronas DA, establecimiento de modelos de PD de ratón, al trasplante de precursores de DA en el estriado de los modelos de PD. Usando este protocolo, uno puede generar iNSCs de pacientes y donantes sanos y derivar neuronas DA que sean seguras, estandarizadas, escalables y homogéneas para fines de trasplante celular, o para modelar PD en un plato e investigar los mecanismos enfermedad subyacente y desarrollo.

Protocol

Todos los procedimientos deben seguir las directrices del comité institucional de ética de la investigación humana. El consentimiento informado debe obtenerse de pacientes o voluntarios sanos antes de la recolección de sangre. Este protocolo fue aprobado por el comité de ética de la investigación humana de la institución y se realizó de acuerdo con las directrices de la institución para el cuidado y uso de animales. 1. Recogida, aislamiento y expansión de los PBMN …

Representative Results

Aquí, informamos de un protocolo que cubre diferentes etapas de la terapia celular iNSC-DA para tratar modelos de DP. En primer lugar, los PBMNAC fueron aislados y ampliados, y reprogramados en iNSCs por infección por SeV. En la Figura 1se muestra una representación esquemática de los procedimientos con expansión PBMNC e inducción de iNSC. El día -14, los PBMNAC se aislaron utilizando un medio de gradiente de densidad (Tablade materiales). Antes de la centrifugación,…

Discussion

Aquí presentamos un protocolo que cubrió diferentes etapas de la terapia celular iNSC-DA para modelos de DP. Los aspectos críticos de este protocolo incluyen: (1) aislamiento y expansión de PBMNCs y reprogramación de PBMNCs en iNSCs por infección SeV, (2) diferenciación de iNSCs a las neuronas DA, (3) establecimiento de modelos unilaterales de ratón PD 6-OHDA-lesioned y comportamiento evaluación, y (4) trasplante de células de precursores de la DA y evaluación del comportamiento.

En…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

El trabajo fue apoyado por las siguientes subvenciones: Stem Cell and Translation National Key Project (2016YFA0101403), National Natural Science Foundation of China (81661130160, 81422014, 81561138004), Beijing Municipal Natural Science Foundation (5142005), Beijing Municipal Natural Science Foundation (5142005), Beijing Municipal Natural Science Foundation (5142005), Beijing Municipal Natural Science Foundation (5142005), Beijing Municipal Natural Science Foundation (5142005), Beijing Municipal Natural Science Foundation (5142005), Beijing Municipal Natural Science Foundation (5142005), Beijing Municipal Natural Science Foundation (5142005), Beijing Municipal Natural Science Foundation (5142005), Beijing Municipal Natural Science Foundation (5142005), Beijing Municipal Natural Science Foundation (5142005), Beijing Municipal Natural Science Foundation (5142005), Beijing Municipal Natural Science Foundation (5142005), Beijing Municipal Natural Beijing Talents Foundation (2017000021223TD03), Proyecto de Apoyo a Profesores de Alto Nivel en las Universidades Municipales de Beijing en el Período de 13o Plan Quinquenal (CIT & TCD20180333), Beijing Medical System High Level Talent Award (2015-3-063), Beijing Beijing Fondo Municipal de la Comisión de Salud (PXM 2018_026283_000002), Beijing Cien, Mil y Diez Mil Talentos (2018A03), Beijing Municipal Administration of Hospitals Clinical Medicine Development of Special Funding Support (ZYLX201706), y el Royal Society-Newton Advanced Fellowship (NA150482).

Materials

15-ml conical tube Corning 430052
1-Thioglycerol Sigma-Aldrich M6145 Toxic for inhalation and skin contact
24-well plate Corning 3337
50-ml conical tube  Corning 430828
6-OHDA Sigma-Aldrich H4381
6-well plate Corning 3516
Accutase Invitrogen A11105-01 Cell dissociation reagent
Apomorphine Sigma-Aldrich A4393
Ascorbic acid Sigma-Aldrich A92902 Toxic with skin contact 
B27 supplement  Invitrogen 17504044
BDNF Peprotech 450-02 Brain derived neurotrophic factor
Blood collection tubes containing sodium heparin BD 367871
BSA yisheng 36106es60 Fetal bovine serum
cAMP Sigma-Aldrich D0627 Dibutyryladenosine cyclic monophosphate
CellBanker 2 ZENOAQ 100ml Used as freezing medium for PBMNCs
Chemically defined lipid concentrate Invitrogen 11905031
CHIR99021 Gene Operation 04-0004
Coverslip Fisher 25*25-2
DAPI Sigma-Aldrich D8417-10mg
DAPT Sigma-Aldrich D5942
Dexamethasone Sigma-Aldrich D2915-100MG
DMEM-F12 Gibco 11330
DMEM-F12 Gibco 11320
Donkey serum Jackson 017-000-121
EPO Peprotech 100-64-50UG Human Erythropoietin
FGF8b Peprotech 100-25
Ficoll-Paque Premium GE Healthcare 17-5442-02 P=1.077, density gradient medium
GDNF Peprotech 450-10 Glial derived neurotrophic factor
GlutaMAX Invitrogen 21051024 100 × Glutamine stock solution
Ham's-F12 Gibco 11765-054
HBSS Invitrogen 14175079 Balanced salt solution
Human leukemia inhibitory factor Millpore LIF1010
Human recombinant SCF Peprotech 300-07-100UG
IGF-1 Peprotech 100-11-100UG Human insulin-like growth factor 
IL-3 Peprotech 200-03-10UG Human interleukin 3
IMDM Gibco 215056-023 Iscove's modified Dulbecco's medium
Insulin Roche  12585014
ITS-X Invitrogen 51500-056 Insulin-transferrin-selenium-X supplement
Knockout serum replacement Gibco 10828028 Serum free basal medium
Laminin Roche  11243217001
Microsyringe Hamilton 7653-01
N2 supplement  Invitrogen 17502048
NEAA Invitrogen 11140050 Non-essential amino acid
Neurobasal Gibco 10888 Basic medium
PDL Sigma-Aldrich P7280 Poly-D-lysine
SAG1 Enzo ALX-270-426-M01
SB431542 Gene Operation 04-0010-10mg Store from light at -20℃
Sendai virus Life Technologies MAN0009378
Sucrose baiaoshengke
TGFβⅢ Peprotech 100-36E Transforming growth factor  βⅢ
Transferrin R&D Systems 2914-HT-100G
Triton X 100 baiaoshengke Nonionic surfactant
Trypan blue Gibco T10282
Xylazine Sigma-Aldrich X1126

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Cite This Article
Zheng, W., Chen, Z. Generation of Induced Neural Stem Cells from Peripheral Mononuclear Cells and Differentiation Toward Dopaminergic Neuron Precursors for Transplantation Studies. J. Vis. Exp. (149), e59690, doi:10.3791/59690 (2019).

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