Generación de células madre neuronales inducidas a partir de células mononucleares periféricas y diferenciación hacia precursores de neuronas dopaminérgicas para estudios de trasplante

La enfermedad de Parkinson (PD) es un trastorno neurodegenerativo común, causado por la degeneración de las neuronas dopaminérgicas (DA) en la sustancia nigra pars compacta (SNpc) en el mesencéfalo ventral (VM), con una prevalencia de más del 1% en la población mayor de 60 años de edad ^{1 , 2}. Durante la última década, la terapia celular, dirigida a sustituir las células degenerativas o dañadas, o nutrir el microambiente alrededor de las neuronas degenerativas, ha demostrado potencial en el tratamiento de la DP^3. Mientras tanto, la tecnología de reprogramación ha hecho progresos significativos⁴, que proporciona una fuente celular prometedora para la terapia de reemplazo. Se ha demostrado que las células madre pluripotentes inducidas por el hombre (iPSC) y las células madre embrionarias (ESC) son capaces de diferenciarse en células neuronales DA, que podrían sobrevivir, madurar y mejorar las funciones motoras cuando se injertan en modelos de DP de rata y primate no humano^{5 ,6,7,8}. los iPSC representan un hito en las tecnologías de reprogramación celular y tienen un gran potencial en el trasplante de células; sin embargo, todavía existe una preocupación sobre el riesgo de formación de tumores de las células incompletamente diferenciadas. Una fuente celular alternativa para el trasplante de células es la que las células madre adultas cometidas por linajes se obtienen a través de la reprogramación directa, como las células madre neurales inducidas (iNSC), que pueden derivarse de los intermediarios inestables, evitando la pluripotencia etapa^9,10,11.

Tanto los ISPC como los iNSC pueden reprogramarse a partir de fuentes celulares autólogas, como fibroblastos, células mononucleares de sangre periférica (PBMNC) y varios otros tipos de células^12,13,14,reduciendo así la inmunogenicidad de las células trasplantadas en gran medida. Además, en comparación con los iPSC, los iNSC son inherentes a la reducción del riesgo de formación de tumores y la plasticidad comprometida con el linaje, sólo capaces de diferenciarse en neuronas y glia¹¹. En los estudios iniciales, se generaron iPSCs humanos o ratón e iNSC a partir de fibroblastos obtenidos a partir de biopsias cutáneas, que es un procedimiento invasivo^14,15. Con este respecto, los PBMNC sson una fuente de células de inicio atractiva debido al proceso de muestreo menos invasivo, y la facilidad para obtener un gran número de células dentro de un corto período de tiempo de expansión¹⁶. Los estudios iniciales de reprogramación emplearon sistemas de administración integrador, como vectores lentivirales o retrovirales, que son eficientes y fáciles de implementar en muchos tipos de células^17; sin embargo, estos sistemas de administración pueden causar mutaciones y reactivación de transgenes residuales, que presentan problemas de seguridad con fines terapéuticos clínicos^12. El virus DeSendai (SeV) es un virus de ARN no integrador con un genoma de una sola cadena de sentido negativo que no se integra en el genoma del huésped, sino que sólo se replica en el citoplasma de las células infectadas, ofreciendo un vehículo eficiente y seguro para la reprogramación^{18 ,19}. Hay disponibles vectores SeV recombinantes que contienen factores de reprogramación, incluidos los modelos humanos OCT3/4, SOX2, KLF4 y c-MYC en sus marcos de lectura abiertos. Además, los vectores virales SeV pueden mejorarse aún más mediante la introducción de mutaciones sensibles a la temperatura, de modo que podrían eliminarse rápidamente cuando la temperatura de cultivo se eleva a 39 oC²⁰. En este artículo, se describe un protocolo para reprogramar PBX a iNSCs mediante el sistema SeV.

Muchos estudios han reportado derivación de neuronas DA de ESCs humanas o iPSC utilizando varios métodos^6,8,21. Sin embargo, hay una escasez de protocolos que describen la diferenciación de las neuronas DA de iNSCs en detalle. En este protocolo, describiremos la generación eficiente de neuronas DA a partir de iNSCs utilizando un método de dos etapas. Los precursores neuronales DA se pueden trasplantar al estriado de los modelos de ratón PD para evaluaciones de seguridad y eficacia. Este artículo presentará un protocolo detallado que cubre varias etapas desde la generación de células madre neurales inducidas por el virus Sendai, diferenciación de iNSCs en neuronas DA, establecimiento de modelos de PD de ratón, al trasplante de precursores de DA en el estriado de los modelos de PD. Usando este protocolo, uno puede generar iNSCs de pacientes y donantes sanos y derivar neuronas DA que sean seguras, estandarizadas, escalables y homogéneas para fines de trasplante celular, o para modelar PD en un plato e investigar los mecanismos enfermedad subyacente y desarrollo.