Periferik mononükleer hücrelerden Indüklenen nöral kök hücrelerin üretimi ve transplantasyon çalışmaları için Dopaminergic neuron precursors doğru farklılaşma
Summary
Protokol, çevresel kan mononükleer hücrelerin yeniden programlanması ile sinirsel kök hücrelerini Sendai virüs enfeksiyonu, dopaminerjik nöronlar içine inscs farklılaşma, tek taraflı-lesioned içine da öncüleri transplantasyon teşvik sunar Parkinson hastalığı fare modelleri ve PD tedavisi için iNSC-türetilen DA öncüleri güvenlik ve etkinliğini değerlendirilmesi.
Abstract
Parkinson hastalığı (PD), ventral mezensefalon (VM) içinde kanıtlanmış bir Nigra pars Compacta (snpc) dopaminerjik (da) nöronların dejenerasyonu nedeniyle oluşur. Hücre replasman tedavisi PD tedavisi için büyük söz tutar. son zamanlarda, indüklenen nöral kök hücreler (SCS) tümör oluşumu riski azalmış ve plastisite nedeniyle hücre değiştirme tedavisi için potansiyel bir aday olarak ortaya çıkmıştır bölgeye özgü nöronlar ve glia. ınscs, fibroblastlar, periferik kan mononükleer hücreler (PBMNCs) ve diğer çeşitli hücre türleri gibi otolog somatik hücresel kaynaklardan yeniden programlanabilmektedir. Diğer somatik hücreler ile karşılaştırıldığında, PBMNCs kültür erişim ve genişletme kolaylığı nedeniyle cazip bir başlangıç hücresi türüdür. , İnsan OCT3/4, SOX2, KLF4 ve c-myc dahil olmak üzere yeniden programlama faktörleri kodlama, bir RNA olmayan Integrative virüs Sendai virüs (sev), bir negatif duygusu vardır, tek-telli, olmayan segmentli genom içine entegre değildir Ana genom, ancak virüslü hücrelerin sitoplazmasında çoğaltır, yeniden programlama için verimli ve güvenli bir araç sunuyor. Bu çalışmada, PBMNCs ‘yi yeniden programlama ve iki aşamalı bir yöntemle özel VM DA nöronlara ayırt edilen ınscs ‘nin elde edildiği bir protokol açıklanmaktadır. Daha sonra DA öncüleri tek taraflı 6-hyrokydopamin (6-OHDA)-lesioned PD fare modellerini PD tedavisinde güvenlik ve etkinliğini değerlendirmek için nakledilir. Bu yöntem, hasta özel DA nöral hücrelerinin in vitro ve in vivo fonksiyonlarını ve terapötik etkilerini araştırmak için bir platform sağlar.
Introduction
Parkinson hastalığı (PD) ortak bir nörodejeneratif hastalıktır, dopaminerjik dejenerasyon neden olur (da) nöronlar üzerinde kanıtlanmış Nigra pars Compacta (snpc) ventral mezensefalon (VM), üzerinde prevalansı ile% 1 daha fazla nüfusu 60 yaş üzerinde 1 , 2. son on yıl içinde, hücre terapisi, ya dejeneratif veya hasarlı hücrelerin değiştirilmesi ya da dejenere nöronlar etrafında mikroçevre BESLEYICI, PD3tedavisinde potansiyel göstermiştir. Bu arada, yeniden programlama teknolojisi önemli ilerleme yaptı4, hangi yedek terapi için umut verici bir hücresel kaynak sağlar. İnsan kaynaklı pluripotent kök hücreleri (ıpscs) ve embriyonik kök hücreler (ESCs) DA nöral hücrelere ayırt edebilmek için kanıtlanmıştır, hangi hayatta olabilir, olgunlandırmak, ve sıçan ve non-insan primat PD modelleri içine grepte motor fonksiyonları geliştirmek5 ,6,7,8. ıpscs, hücresel yeniden programlama teknolojilerinde bir kilometre taşı temsil eder ve hücre nakli konusunda büyük bir potansiyele sahiptir; Ancak, hala tamamen farklılaşmış hücrelerden tümör oluşumu riski hakkında bir endişe vardır. Hücre transplantasyonu için alternatif bir hücresel kaynak olan, kararsız ara kaynaklarından elde edilebilir olan indüklenen nöral kök hücreler (ınscs) gibi, doğrudan yeniden programlama yoluyla elde edilen kökten işlenen yetişkin kök hücrelerdir. aşama9,10,11.
Hem ipscs hem de ınscs, fibroblastlar, periferik kan mononükleer hücreler (pbmncs) ve diğer çeşitli hücre türleri12,13,14gibi otolog hücresel kaynaklardan yeniden programlanabilmektedir, böylece büyük bir dereceye kadar nakledilen hücrelerin immünogenisite. Dahası, IPhone ‘lar ile karşılaştırıldığında, ınscs, tümör oluşumu ve sırtı işlenmiş plastisite riski azalmış, sadece nöronlar ve glia11farklılaştırmak mümkün. İlk çalışmalarda, invaziv bir prosedür olan cilt biyopsisinden elde edilen fibroblastlar arasında insan ya da fare ıpscs ve ınscs oluşturuldu14,15. Bu bağlamda, PBMNCs daha az invaziv örnekleme işlemi nedeniyle cazip bir başlangıç hücresi kaynağıdır ve genişleme süresi kısa bir süre içinde çok sayıda hücre elde etmek kolaylığı16. İlk yeniden programlama çalışmaları, lentiviral veya retroviral vektörler gibi İntegratif teslimat sistemlerini kullanan, birçok hücre türü içinde verimli ve kolay uygulanabilen17; Ancak bu teslimat sistemleri, klinik terapötik amaçlar için güvenlik sorunları mevcut olan kalan transgenler, mutasyonlar ve yeniden aktivasyonuna neden olabilir12. Sendai virüs (SeV) bir non-Integrative RNA virüsü bir negatif anlamda, ana genom içine entegre değildir tek telli genom, ancak virüslü hücrelerin sitoplazmasında çoğaltır, yeniden programlama için verimli ve güvenli bir araç sunan18 ,19. Rekombinant SeV vektörler, açık okuma çerçevelerinde insan OCT3/4, SOX2, KLF4 ve c-myc gibi yeniden programlama faktörleri içeren kullanılabilir. Buna ek olarak, SeV viral vektörler, sıcaklık duyarlı mutasyonlar sunarak daha da iyileştirilebilir, böylece kültür sıcaklığı 39 °C ‘ ye yükseltildiğinde hızla kaldırılabilirler.20. Bu yazıda, PBMNCs ‘i SeV sistemini kullanarak yeniden programlamak için bir protokol açıklanmaktadır.
Birçok çalışmalar insan ESCS veya ipscs çeşitli yöntemler6,8,21kullanarak da nöronların türetme bildirdi. Bununla birlikte, ınscs ‘deki DA nöronların farklılaşması ayrıntılarını açıklayan bir protokol sıkıntısı vardır. Bu protokolde, iki aşamalı bir yöntem kullanarak ınscs ‘deki DA nöronların verimli oluşumunu açıklayacağız. DA nöronal öncüleri güvenlik ve etkinlik değerlendirmeleri için PD fare modellerinin striatum içine nakledilebilir. Bu makalede, Sendai virüsü tarafından indüklenen nöral kök hücrelerin nesil çeşitli aşamaları kapsayan ayrıntılı bir protokol sunacak, DA nöronlar içine ınscs farklılaşma, fare PD modellerinin kurulması, striatum içine DA öncüleri nakli için , PD modellerinin. Bu protokol kullanılarak, hastalar ve sağlıklı bağışçıların ınscs oluşturabilir ve hücre transplantasyonu amacıyla güvenli, standartlanabilir, ölçeklenebilir ve homojen olan DA nöronlar türetebilirsiniz veya PD ‘yi bir tabak içinde modelleme ve mekanizmaların incelenmesi temel hastalık başlangıcı ve gelişimi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada PD modelleri için INsc-DA hücre tedavisinin farklı aşamaları kapsanan bir protokol sundu. Bu protokolün kritik yönleri şunlardır: (1) pbmncs izolasyonu ve genişlemesi ve pbmncs ‘nin ınscs ‘ye yeniden programlanması, (2) ınscs ‘nin da nöronlara farklılaşması, (3) tek taraflı 6-OHDA-lesioned PD fare modellerinin kurulması ve davranışsal ve (4) DA öncüleri ve davranışsal değerlendirmesinin hücre nakli.
Bu protokolde ilk bölüm, eritroblastları tercih eden ve le…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Çalışma aşağıdaki hibe tarafından desteklenmektedir: kök hücre ve çeviri ulusal anahtar projesi (2016YFA0101403), Çin Ulusal Doğal Bilim Vakfı (81661130160, 81422014, 81561138004), Pekin Belediye doğal Bilim Vakfı (5142005), Pekin yetenekleri Vakfı (2017000021223TD03), destek projesi yüksek düzey öğretmenler Pekin Belediye üniversitelerinde 13 beş yıl dönemi planı (CıT & TCD20180333), Pekin tıbbi sistem yüksek seviyeli Yetenek Ödülü (2015-3-063), Pekin Belediye Sağlık Komisyonu Fonu (PXM 2018_026283_000002), Pekin 100, Thousand, ve 10000 yetenekler Fonu (2018A03), Pekin Belediye Hastanesi özel finansman desteğinin klinik tıp gelişimi (ZYLX201706) ve Royal Society-Newton gelişmiş Bursu (NA150482).
Materials
| 15-ml conical tube | Corning | 430052 | |
| 1-Thioglycerol | Sigma-Aldrich | M6145 | Toxic for inhalation and skin contact |
| 24-well plate | Corning | 3337 | |
| 50-ml conical tube | Corning | 430828 | |
| 6-OHDA | Sigma-Aldrich | H4381 | |
| 6-well plate | Corning | 3516 | |
| Accutase | Invitrogen | A11105-01 | Cell dissociation reagent |
| Apomorphine | Sigma-Aldrich | A4393 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A92902 | Toxic with skin contact |
| B27 supplement | Invitrogen | 17504044 | |
| BDNF | Peprotech | 450-02 | Brain derived neurotrophic factor |
| Blood collection tubes containing sodium heparin | BD | 367871 | |
| BSA | yisheng | 36106es60 | Fetal bovine serum |
| cAMP | Sigma-Aldrich | D0627 | Dibutyryladenosine cyclic monophosphate |
| CellBanker 2 | ZENOAQ | 100ml | Used as freezing medium for PBMNCs |
| Chemically defined lipid concentrate | Invitrogen | 11905031 | |
| CHIR99021 | Gene Operation | 04-0004 | |
| Coverslip | Fisher | 25*25-2 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D8417-10mg | |
| DAPT | Sigma-Aldrich | D5942 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D2915-100MG | |
| DMEM-F12 | Gibco | 11330 | |
| DMEM-F12 | Gibco | 11320 | |
| Donkey serum | Jackson | 017-000-121 | |
| EPO | Peprotech | 100-64-50UG | Human Erythropoietin |
| FGF8b | Peprotech | 100-25 | |
| Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare | 17-5442-02 | P=1.077, density gradient medium |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | Glial derived neurotrophic factor |
| GlutaMAX | Invitrogen | 21051024 | 100 × Glutamine stock solution |
| Ham's-F12 | Gibco | 11765-054 | |
| HBSS | Invitrogen | 14175079 | Balanced salt solution |
| Human leukemia inhibitory factor | Millpore | LIF1010 | |
| Human recombinant SCF | Peprotech | 300-07-100UG | |
| IGF-1 | Peprotech | 100-11-100UG | Human insulin-like growth factor |
| IL-3 | Peprotech | 200-03-10UG | Human interleukin 3 |
| IMDM | Gibco | 215056-023 | Iscove's modified Dulbecco's medium |
| Insulin | Roche | 12585014 | |
| ITS-X | Invitrogen | 51500-056 | Insulin-transferrin-selenium-X supplement |
| Knockout serum replacement | Gibco | 10828028 | Serum free basal medium |
| Laminin | Roche | 11243217001 | |
| Microsyringe | Hamilton | 7653-01 | |
| N2 supplement | Invitrogen | 17502048 | |
| NEAA | Invitrogen | 11140050 | Non-essential amino acid |
| Neurobasal | Gibco | 10888 | Basic medium |
| PDL | Sigma-Aldrich | P7280 | Poly-D-lysine |
| SAG1 | Enzo | ALX-270-426-M01 | |
| SB431542 | Gene Operation | 04-0010-10mg | Store from light at -20℃ |
| Sendai virus | Life Technologies | MAN0009378 | |
| Sucrose | baiaoshengke | ||
| TGFβⅢ | Peprotech | 100-36E | Transforming growth factor βⅢ |
| Transferrin | R&D Systems | 2914-HT-100G | |
| Triton X 100 | baiaoshengke | Nonionic surfactant | |
| Trypan blue | Gibco | T10282 | |
| Xylazine | Sigma-Aldrich | X1126 |
References
- Williams-Gray, C. H., et al. The distinct cognitive syndromes of Parkinson’s disease: 5 year follow-up of the CamPaIGN cohort. Brain. 132, 2958-2969 (2009).
- Dexter, D. T., Jenner, P. Parkinson disease: from pathology to molecular disease mechanisms. Free Radical Biology and Medicine. 62, 132-144 (2013).
- Chen, Z. Cell Therapy for Parkinson’s Disease: New Hope from Reprogramming Technologies. Aging and Disease. 6 (6), 499-503 (2015).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Doi, D., et al. Isolation of human induced pluripotent stem cell-derived dopaminergic progenitors by cell sorting for successful transplantation. Stem Cell Reports. 2 (3), 337-350 (2014).
- Kriks, S., et al. Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson’s disease. Nature. 480 (7378), 547-551 (2011).
- Perrier, A. L., et al. Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (34), 12543-12548 (2004).
- Kikuchi, T., et al. Human iPS cell-derived dopaminergic neurons function in a primate Parkinson’s disease model. Nature. 548 (7669), 592-596 (2017).
- Ma, T., Xie, M., Laurent, T., Ding, S. Progress in the reprogramming of somatic cells. Circulation Research. 112 (3), 562-574 (2013).
- Tang, X., et al. Conversion of adult human peripheral blood mononuclear cells into induced neural stem cell by using episomal vectors. Stem Cell Research. 16 (2), 236-242 (2016).
- Yuan, Y., et al. Dopaminergic precursors differentiated from human blood-derived induced neural stem cells improve symptoms of a mouse Parkinson’s disease model. Theranostics. 8 (17), 4679-4694 (2018).
- Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nature Biotechnology. 26 (11), 1276-1284 (2008).
- Thier, M., et al. Direct conversion of fibroblasts into stably expandable neural stem cells. Cell Stem Cell. 10 (4), 473-479 (2012).
- Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures. Nature Protocols. 2 (12), 3081-3089 (2007).
- Seki, T., Yuasa, S., Fukuda, K. Generation of induced pluripotent stem cells from a small amount of human peripheral blood using a combination of activated T cells and Sendai virus. Nature Protocols. 7 (4), 718-728 (2012).
- Bazley, F. A., et al. Direct Reprogramming of Human Primordial Germ Cells into Induced Pluripotent Stem Cells: Efficient Generation of Genetically Engineered Germ Cells. Stem Cells and Development. 24 (22), 2634-2648 (2015).
- Li, H. O., et al. A cytoplasmic RNA vector derived from nontransmissible Sendai virus with efficient gene transfer and expression. Journal of Virology. 74 (14), 6564-6569 (2000).
- Sochacki, J., Devalle, S., Reis, M., Mattos, P., Rehen, S. Generation of urine iPS cell lines from patients with Attention Deficit Hyperactivity Disorder (ADHD) using a non-integrative method. Stem Cell Research. 17 (1), 102-106 (2016).
- Ban, H., et al. Efficient generation of transgene-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) by temperature-sensitive Sendai virus vectors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (34), 14234-14239 (2011).
- Cho, M. S., et al. Highly efficient and large-scale generation of functional dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (9), 3392-3397 (2008).
- Dowey, S. N., Huang, X., Chou, B. -. K., Ye, Z., Cheng, L. Generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from postnatal blood mononuclear cells by plasmid vector expression. Nature Protocols. 7 (11), 2013-2021 (2012).
- Zhu, S., et al. Reprogramming of human primary somatic cells by OCT4 and chemical compounds. Cell Stem Cell. 7 (6), 651-655 (2010).
- Ono, Y., et al. Differences in neurogenic potential in floor plate cells along an anteroposterior location: midbrain dopaminergic neurons originate from mesencephalic floor plate cells. Development. 134 (17), 3213-3225 (2007).
- Kirkeby, A., et al. Generation of regionally specified neural progenitors and functional neurons from human embryonic stem cells under defined conditions. Cell Reports. 1 (6), 703-714 (2012).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
- Fasano, C. A., Chambers, S. M., Lee, G., Tomishima, M. J., Studer, L. Efficient derivation of functional floor plate tissue from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 6 (4), 336-347 (2010).
- Harvey, B. K., Wang, Y., Hoffer, B. J. Transgenic rodent models of Parkinson’s disease. Acta Neurochirurgica Supplements. 101, 89-92 (2008).
- Sheng, C., et al. Generation of dopaminergic neurons directly from mouse fibroblasts and fibroblast-derived neural progenitors. Cell Research. 22 (4), 769-772 (2012).
- Prasad, A., et al. A review of induced pluripotent stem cell, direct conversion by trans-differentiation, direct reprogramming and oligodendrocyte differentiation. Regenerative Medicine. 11 (2), 181-191 (2016).
