Summary

末梢単核細胞からの誘導神経幹細胞の生成と移植研究におけるドーパミン作動性ニューロン前駆体への分化

Published: July 11, 2019
doi:

Summary

このプロトコルは、仙台ウイルス感染による神経幹細胞を誘導する末梢血単核細胞のリプログラミング、ドーパミン作動性ニューロンへのiNSCの分化、DA前駆体の一方的な病変への移植を提示するパーキンソン病マウスモデル、およびPD治療のためのiNSC由来DA前駆体の安全性および有効性の評価。

Abstract

パーキンソン病(PD)は、腹部メセンスファロン(VM)における基数ニグラパースコンパクター(SNpc)におけるドーパミン作動性(DA)ニューロンの変性によって引き起こされる。細胞置換療法はPDの治療に大きな期待を寄せており、最近、腫瘍形成のリスクが低下し、可塑性が生じるため、誘導神経幹細胞(iNSC)が細胞補充療法の候補として浮上している。領域特異的ニューロンとグリア。iNSCは、線維芽細胞、末梢血単核細胞(PBMNC)および様々な他のタイプの細胞などの自家体細胞源から再プログラムすることができる。他のタイプの体細胞と比較して、PBMNCは培養中にアクセスし、拡大しやすいので魅力的なスターターセルタイプです。センダイウイルス(SeV)は、ヒトOCT3/4、SOX2、KLF4およびc-MYCを含む再プログラミング因子をコードするRNA非統合型ウイルスであり、ネグレーション、一本鎖、非セグメントゲノムを有し、 宿主ゲノムは、感染した細胞の細胞質でのみ複製し、リプログラミングのための効率的で安全な手段を提供する。本研究では,PBMNCを再プログラミングしてiNSCを得るプロトコルを用いて,2段階の方法で特殊なVM DAニューロンに分化するプロトコルについて述べた.次に、DA前駆体を一方的に6-ヒロキシドパミン(6-OHDA)病変PDマウスモデルに移植し、PDの治療の安全性と有効性を評価する。この方法は、インビトロおよびインビボにおける患者特異的DA神経細胞の機能および治療効果を調べるためのプラットフォームを提供する。

Introduction

パーキンソン病(PD)は、視室メゼンサロン(VM)におけるドーパミン作動性(DA)ニューロンの変性によって引き起こされる一般的な神経変性疾患であり、60歳以上の人口で1%以上の有病率を有する。1,2.過去10年間にわたり、細胞療法は、変性または損傷した細胞を置き換えるか、または変性ニューロンの周りの微小環境に栄養を与えることを目的とし、PD3の治療における可能性を示している。一方、リプログラミング技術は、補充療法のための有望な細胞源を提供する4、大きな進歩を遂げました。ヒト誘導多能性幹細胞(iPSC)と胚性幹細胞(ESC)は、ラットおよび非ヒト霊長類PDモデルに移植すると、生き残り、母性、運動機能を改善することができるDA神経細胞に分化できることが証明されている5 ,6,7,8.iPSCは細胞リプログラミング技術のマイルストーンであり、細胞移植の大きな可能性を秘めています。しかし、不完全に分化した細胞からの腫瘍形成のリスクについては、依然として懸念がある。細胞移植のための代替細胞源は、不安定な中間体から導き出すことができる誘導神経幹細胞(iNSC)などの直接リプログラミングを通じて得られた系統コミット成人幹細胞であり、多能性をバイパスするステージ9,10,11.

iPSCとiNsCの両方は、線維芽細胞、末梢血単核細胞(PBMcNC)および様々な他のタイプの細胞12、13、14などの自家細胞源から再プログラムすることができ、したがって、移植細胞の免疫原性を大いに高める。さらに、iPSCと比較して、iNSCは腫瘍形成および系統コミット可塑性のリスクが減少し、ニューロンおよびグリア11に区別することができるだけである。初期研究では、ヒトまたはマウスのiPSCおよびiNSCは、侵襲的処置14、15である皮膚生検から得られた線維芽細胞から生成された。これに関して、PBMNCは、侵襲性の低いサンプリングプロセスのため魅力的なスターター細胞源であり、拡張時間16の短い期間内に多数の細胞を得ることが容易である。初期のリプログラミング研究では、レンチウイルスベクターやレトロウイルスベクターなどの統合デリバリーシステムを採用し、多くのタイプの細胞で効率的かつ簡単に実装できます17;しかしながら、これらの送達システムは、残留トランスジーンの変異および再活性化を引き起こす可能性があり、これは臨床治療目的12の安全性問題を提示する。センダイウイルス(SeV)は、宿主ゲノムに統合されない負感のある一本鎖ゲノムを持つ非統合型RNAウイルスであるが、感染細胞の細胞質中にのみ複製し、リプログラミングのための効率的で安全な手段を提供する18 、19.組換えSeVベクトルは、オープンリーディングフレームにヒトOCT3/4、SOX2、KLF4およびc-MYCを含む再プログラミング因子を含む利用可能です。 さらに、SeVウイルスベクターは、温度感受性変異を導入することによってさらに改善することができ、培養温度が39°C20に上昇したときに迅速に除去することができる。この記事では、SeV システムを使用して PBMC を iNsC に再プログラムするプロトコルについて説明します。

多くの研究は、様々な方法を使用してヒトESCまたはiPSCからDAニューロンの誘導を報告しています 6,8,21.しかし、iNSCからのDAニューロンの分化を詳細に説明するプロトコルが不足しています。このプロトコルでは、2段階法を用いてiNSCからのDAニューロンの効率的な生成について述べた。DAニューロン前駆体は、安全性および有効性評価のためのPDマウスモデルの線条体に移植することができる。本稿では、仙台ウイルスによる誘導神経幹細胞の生成、DAニューロンへのiNSCの分化、マウスPDモデルの確立、DA前駆体の線条体への移植まで、様々な段階をカバーする詳細なプロトコルを紹介する。PDモデルの。このプロトコルを使用して、患者や健康なドナーからiNSCを生成し、細胞移植の目的のために安全、標準化、スケーラブルで均質なDAニューロンを導き出したり、皿の中でPDをモデル化したり、メカニズムの調査を行うことができます。根本的な病気の発症と発症。

Protocol

すべての手続きは、制度的な人間研究倫理委員会のガイドラインに従わなければならない。インフォームド・コンセントは、採血前に患者または健康なボランティアから得る必要があります。このプロトコルは、機関の人間研究倫理委員会によって承認され、動物のケアと使用のための機関のガイドラインに従って行われました. 1. PBMNCの収集、隔離、拡張 P…

Representative Results

ここでは、PDモデルを治療するためのiNSC-DA細胞療法の異なる段階をカバーするプロトコルを報告する。まず、PBMNCを単離して拡張し、SeV感染によりiNsCに再プログラムした。PBMNC 拡張および iNSC 誘導を使用した手順の概略図を図1に示します。14日目、PBMNCは密度勾配媒体(材料の表)を用いて単離した。遠心分離の前に、PBSと密度勾配媒体で希釈した血液を2層に…

Discussion

ここでは、PDモデルに対するiNSC-DA細胞療法の異なる段階をカバーするプロトコルを紹介した。このプロトコルの重要な側面は、(1)PBMNCの単離と拡大、SeV感染によるiNSCへのPBNCのリプログラミング、(2)INSCとDAニューロンの分化、(3)一方的な6-OHDA病変PDマウスモデルと行動の確立DA前駆体の細胞移植および行動評価

このプロトコルでは、最初の部分は、優先的にエリスロブラス…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、幹細胞と翻訳国家キープロジェクト(2016YFA0101403)、中国国立自然科学財団(81661130160、81422014、81561138004)、北京市自然科学財団(5142005)の助成金によって支援されました。北京タレント財団(201700021223TD03)、第13次5カ年計画(CIT&TCD20180333)、北京医療システムハイレベル人材賞(2015-3-063)の北京市立大学の高レベル教師支援プロジェクト市保健委員会基金(PXM 2018_026283_000002)、北京100、千、1万人の人材基金(2018A03)、北京市病院行政特別資金支援(ZYLX201706)、ロイヤル・ソサエティ・ニュートン・アドバンスト・フェローシップ(NA150482)。

Materials

15-ml conical tube Corning 430052
1-Thioglycerol Sigma-Aldrich M6145 Toxic for inhalation and skin contact
24-well plate Corning 3337
50-ml conical tube  Corning 430828
6-OHDA Sigma-Aldrich H4381
6-well plate Corning 3516
Accutase Invitrogen A11105-01 Cell dissociation reagent
Apomorphine Sigma-Aldrich A4393
Ascorbic acid Sigma-Aldrich A92902 Toxic with skin contact 
B27 supplement  Invitrogen 17504044
BDNF Peprotech 450-02 Brain derived neurotrophic factor
Blood collection tubes containing sodium heparin BD 367871
BSA yisheng 36106es60 Fetal bovine serum
cAMP Sigma-Aldrich D0627 Dibutyryladenosine cyclic monophosphate
CellBanker 2 ZENOAQ 100ml Used as freezing medium for PBMNCs
Chemically defined lipid concentrate Invitrogen 11905031
CHIR99021 Gene Operation 04-0004
Coverslip Fisher 25*25-2
DAPI Sigma-Aldrich D8417-10mg
DAPT Sigma-Aldrich D5942
Dexamethasone Sigma-Aldrich D2915-100MG
DMEM-F12 Gibco 11330
DMEM-F12 Gibco 11320
Donkey serum Jackson 017-000-121
EPO Peprotech 100-64-50UG Human Erythropoietin
FGF8b Peprotech 100-25
Ficoll-Paque Premium GE Healthcare 17-5442-02 P=1.077, density gradient medium
GDNF Peprotech 450-10 Glial derived neurotrophic factor
GlutaMAX Invitrogen 21051024 100 × Glutamine stock solution
Ham's-F12 Gibco 11765-054
HBSS Invitrogen 14175079 Balanced salt solution
Human leukemia inhibitory factor Millpore LIF1010
Human recombinant SCF Peprotech 300-07-100UG
IGF-1 Peprotech 100-11-100UG Human insulin-like growth factor 
IL-3 Peprotech 200-03-10UG Human interleukin 3
IMDM Gibco 215056-023 Iscove's modified Dulbecco's medium
Insulin Roche  12585014
ITS-X Invitrogen 51500-056 Insulin-transferrin-selenium-X supplement
Knockout serum replacement Gibco 10828028 Serum free basal medium
Laminin Roche  11243217001
Microsyringe Hamilton 7653-01
N2 supplement  Invitrogen 17502048
NEAA Invitrogen 11140050 Non-essential amino acid
Neurobasal Gibco 10888 Basic medium
PDL Sigma-Aldrich P7280 Poly-D-lysine
SAG1 Enzo ALX-270-426-M01
SB431542 Gene Operation 04-0010-10mg Store from light at -20℃
Sendai virus Life Technologies MAN0009378
Sucrose baiaoshengke
TGFβⅢ Peprotech 100-36E Transforming growth factor  βⅢ
Transferrin R&D Systems 2914-HT-100G
Triton X 100 baiaoshengke Nonionic surfactant
Trypan blue Gibco T10282
Xylazine Sigma-Aldrich X1126

References

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Cite This Article
Zheng, W., Chen, Z. Generation of Induced Neural Stem Cells from Peripheral Mononuclear Cells and Differentiation Toward Dopaminergic Neuron Precursors for Transplantation Studies. J. Vis. Exp. (149), e59690, doi:10.3791/59690 (2019).

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