Generatie van geïnduceerde neurale stamcellen uit perifere mononucleaire cellen en differentiatie naar precursoren voor Dopaminerge neuron voor transplantatie studies

De ziekte van Parkinson (PD) is een gemeenschappelijke neurodegeneratieve aandoening, veroorzaakt door degeneratie van Dopaminerge (DA) neuronen bij de Substantia nigra pars Compacta (SNpc) in de ventrale Mesencephalon (VM), met een prevalentie van meer dan 1% in de populatie van meer dan 60 jaar oud ^{1 , 2}. in de afgelopen tien jaar, cel therapie, gericht op hetzij het vervangen van de degeneratieve of beschadigde cellen, of het voeden van de micro omgeving rond de ontstellende neuronen, heeft aangetoond potentieel in de behandeling van PD³. Ondertussen heeft herprogrammeerings technologie aanzienlijke vooruitgang geboekt⁴, die een veelbelovende cellulaire bron voor vervangende therapie biedt. Menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) en embryonale stamcellen (Esc’s) zijn bewezen in staat te zijn om te differentiëren in DA neurale cellen, die kunnen overleven, matureren en de motorische functies verbeteren wanneer ze worden geënt in rat en niet-humane primaat PD-modellen^{5 ,6,7,8}. iPSCs vormen een mijlpaal in cellulaire herprogrammeer technologieën en hebben een groot potentieel in celtransplantatie; echter, er is nog steeds een bezorgdheid over het risico van tumorvorming van de niet volledig gedifferentieerde cellen. Een alternatieve cellulaire bron voor celtransplantatie is stamage-gepleegde volwassen stamcellen verkregen door directe herprogrammering, zoals geïnduceerde neurale stamcellen (iNSCs), die kunnen worden afgeleid van de instabiele tussen producten, het omzeilen van de pluripotentie etappe^9,10,11.

Zowel ipscs als inscs kunnen worden geherprogrammeerd vanuit autologe cellulaire bronnen, zoals fibroblasten, perifere bloed mononucleaire cellen (pbmnc’s) en diverse andere soorten cellen^12,13,14, waardoor de immunogeniciteit van getransplanteerde cellen in hoge mate. Bovendien, in vergelijking met iPSCs, iNSCs zijn inherent aan verminderde risico van tumorvorming en Lineage-geëngageerde plasticiteit, alleen in staat om te differentiëren in neuronen en glia¹¹. In de eerste studies werden de ipscs en inscs van mensen of muizen gegenereerd uit fibroblasten verkregen uit huid biopsieën, wat een invasieve ingreep^14,15is. Met dit respect zijn Pbmnc’s een aantrekkelijke starter celbron vanwege het minder invasieve bemonsteringsproces en het gemak om grote aantallen cellen te verkrijgen binnen een korte periode van expansie tijd¹⁶. Initiële herprogrammering studies gebruikt integratieve leveringssystemen, zoals lentivirale of retrovirale vectoren, die efficiënt en gemakkelijk te implementeren in vele soorten cellen¹⁷; Deze toedieningssystemen kunnen echter mutaties en reactivatie van residuele transgenen veroorzaken, die veiligheidsproblemen voor klinische therapeutische doeleinden¹²opleveren. Sendai virus (SeV) is een niet-integratief RNA-virus met een negatief gevoel, enkel-streng genoom dat niet wordt geïntegreerd in gastheer genoom, maar alleen repliceert in het cytoplasma van geïnfecteerde cellen, het aanbieden van een efficiënt en veilig voertuig voor herprogrammering^{18 ,19}. Recombinant SeV vectoren zijn beschikbaar die herprogrammering factoren bevatten, waaronder Human OCT3/4, SOX2, KLF4 en c-myc in hun open reading frames. Bovendien kunnen SeV-virale vectoren verder worden verbeterd door temperatuurgevoelige mutaties in te voeren, zodat ze snel kunnen worden verwijderd wanneer de cultuur temperatuur wordt verhoogd tot 39 °C²⁰. In dit artikel beschrijven we een protocol voor het opnieuw programmeren van PBMNCs naar iNSCs met behulp van het SeV-systeem.

Veel studies hebben gemeld afleiding van da neuronen van menselijke ESCs of ipscs met behulp van verschillende methoden^6,8,21. Er is echter een tekort aan protocollen die de differentiatie van DA-neuronen van iNSCs in Details beschrijven. In dit protocol beschrijven we de efficiënte generatie van DA neuronen van iNSCs met behulp van een tweetraps methode. De DA neuronale precursoren kunnen worden getransplanteerd in het striatum van PD Muismodellen voor de veiligheid en werkzaamheid evaluaties. Dit artikel zal een gedetailleerd protocol dat betrekking heeft op verschillende stadia van de generatie van geïnduceerde neurale stamcellen door Sendai virus, differentiatie van iNSCs in DA neuronen, oprichting van muis PD modellen, voor transplantatie van de voorlopers van de DA in het striatum presenteren. van de PD-modellen. Met dit protocol kan men iNSCs van patiënten en gezonde donoren genereren en DA-neuronen afleiden die veilig, standaardiseerbaar, schaalbaar en homogeen zijn voor celtransplantatie doeleinden, of voor het modelleren van PD in een gerecht en onderzoek van de mechanismen onderliggende ziekte aanvang en ontwikkeling.