Summary

توليد الخلايا الجذعية العصبية المستحثة من الخلايا أحادية النووية الطرفية والتمايز نحو سلائف الخلايا العصبية الدوبامين لدراسات زرع

Published: July 11, 2019
doi:

Summary

يعرض البروتوكول إعادة برمجة الخلايا أحادية النووية في الدم المحيطي للحث على الخلايا الجذعية العصبية عن طريق عدوى فيروس سينداي، والتمايز بين الـ iNSCs في الخلايا العصبية الدوبامينية، وزرع سلائف DA في الآفات من جانب واحد نماذج الماوس مرض باركنسون, وتقييم سلامة وفعالية السلائف DA المستمدة من iNSC لعلاج PD.

Abstract

مرض باركنسون (PD) هو سبب انحطاط الخلايا العصبية الدوبامين (DA) في substantia nigra pars compacta (SNpc) في mesencephalon البطيني (VM). العلاج باستبدال الخلايا يحمل وعدا كبيرا لعلاج PD. في الآونة الأخيرة، ظهرت الخلايا الجذعية العصبية المستحثة (iNSCs) كمرشح محتمل للعلاج استبدال الخلايا بسبب انخفاض خطر تكوين الورم واللدونة التي تؤدي إلى الخلايا العصبية الخاصة بالمنطقة وglia. يمكن إعادة برمجة iNSCs من المصادر الخلوية الجسدية الذاتية، مثل الخلايا الليفية والخلايا أحادية النووية في الدم المحيطي (PBMNCs) وأنواع أخرى مختلفة من الخلايا. بالمقارنة مع أنواع أخرى من الخلايا الجسدية، PBMNCs هي نوع خلية كاتب جذابة بسبب سهولة الوصول والتوسع في الثقافة. Sendai فيروس (SeV)، وهو فيروس RNA غير التكاملي، وترميز عوامل إعادة البرمجة بما في ذلك الإنسان OCT3/4، SOX2، KLF4 و c-MYC ، لديه شعور سلبي ، واحد الذين تقطعت بهم السبل ، الجينوم غير مجزأة التي لا تندمج في الجينوم المضيف، ولكن يتكرر فقط في السيتوبلازم من الخلايا المصابة، وتوفير وسيلة فعالة وآمنة لإعادة برمجة. في هذه الدراسة، ونحن نصف بروتوكول الذي يتم الحصول على iNSCs عن طريق إعادة برمجة PBMNCs، وتميزها في الخلايا العصبية دي أ VM المتخصصة بطريقة من مرحلتين. ثم يتم زرع السلائف DA في من جانب واحد 6-هيروكسيدوبامين (6-OHDA) -نماذج الماوس PD الآفات لتقييم سلامة وفعالية لعلاج PD. توفر هذه الطريقة منصة للتحقيق في وظائف والآثار العلاجية للخلايا العصبية DA الخاصة بالمريض في المختبر وفي الجسم الحي.

Introduction

مرض باركنسون (PD) هو اضطراب عصبي شائع، الناجم عن انحطاط الخلايا العصبية الدوبامين (DA) في substantia nigra pars compacta (SNpc) في mesencephalon البطيني (VM)، مع انتشار أكثر من 1٪ في السكان الذين تزيد أعمارهم عن 60 عاما 1 , 2.على مدى العقد الماضي، والعلاج الخلوي، تهدف إما إلى استبدال الخلايا التنكسية أو التالفة، أو تغذية البيئة الدقيقة حول الخلايا العصبية المتحللة، وقد أظهرت إمكانات في علاج PD3. وفي الوقت نفسه، حققت تكنولوجيا إعادة البرمجة تقدما كبيرا4، والذي يوفر مصدرا الخلوية واعدة للعلاج البديل. وقد ثبت أن الخلايا الجذعية المتعددة القوى التي يسببها الإنسان (iPSCs) والخلايا الجذعية الجنينية (ESCs) قادرة على التمييز في الخلايا العصبية DA، والتي يمكن أن البقاء على قيد الحياة، والنضج، وتحسين وظائف المحرك عند تطعيمها في نماذج PD الرئيسيات الفئران وغير البشرية5 ،6،7،8. وتمثل هذه المراكز معلماً بارزاً في تكنولوجيات إعادة برمجة الخلايا ولها إمكانات كبيرة في مجال زرع الخلايا؛ ومع ذلك، لا يزال هناك قلق بشأن خطر تكوين الورم من الخلايا المتمايزة بشكل غير كامل. مصدر خلوي بديل لزراعة الخلايا هو الخلايا الجذعية البالغة الملتزمة بالسلالات التي يتم الحصول عليها من خلال إعادة البرمجة المباشرة، مثل الخلايا الجذعية العصبية المستحثة (iNSCs)، والتي يمكن اشتقاقها من الوسطاء غير المستقرين، متجاوزين القوى المتعددة المرحلة10،11.

يمكن إعادة برمجة كل من iPSCs وiNSCs من المصادر الخلوية الذاتية، مثل الخلايا الليفية، والخلايا أحادية النووية في الدم المحيطي (PBMNCs) وأنواع أخرى مختلفة من الخلايا12،13،14،مما يقلل من مناعة الخلايا المزروعة إلى حد كبير. وعلاوة على ذلك، بالمقارنة مع iPSCs، iNSCs هي متأصلة مع انخفاض خطر تشكيل الورم واللدونة الملتزمة النسب، قادرة فقط على التمييز في الخلايا العصبية وglia11. في الدراسات الأولية، تم إنشاء iPSCs الإنسان أو الماوس وiNSCs من الخلايا الليفية التي تم الحصول عليها من الخزعات الجلدية، وهو إجراء الغازية14،15. وفي هذا الصدد، فإن مركبات PBMNCs هي مصدر خلايا بداية جذاب بسبب عملية أخذ العينات الأقل تدخلاً، وسهولة الحصول على أعداد كبيرة من الخلايا في غضون فترة قصيرة من فترة التوسع16. استخدمت دراسات إعادة البرمجة الأولية أنظمة التسليم التكاملي، مثل ناقلات الفيروسات اللينة أو الفيروسات الرجعية، والتي هي فعالة وسهلة التنفيذ في العديد من أنواع الخلايا17؛ ومع ذلك، قد تسبب أنظمة التسليم هذه طفرات وإعادة تنشيط الجينات المتحولة المتبقية، والتي تقدم قضايا السلامة لأغراض العلاج السريري12. فيروس سينداي (SeV) هو فيروس RNA غير تكاملي مع جينوم سلبي، واحد الذين تقطعت بهم السبل التي لا تندمج في الجينوم المضيف، ولكن يتكرر فقط في السيتوبلازم من الخلايا المصابة، وتقديم وسيلة فعالة وآمنة لإعادة برمجة18 ،19. تتوفر متجهات SeV المؤتلفة التي تحتوي على عوامل إعادة برمجة بما في ذلك OCT3/4الإنسان، SOX2، KLF4 و c-MYC في إطارات القراءة المفتوحة الخاصة بهم. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن زيادة تحسين ناقلات الفيروس SeV عن طريق إدخال طفرات حساسة لدرجة الحرارة، بحيث يمكن إزالتها بسرعة عندما يتم رفع درجة حرارة الثقافة إلى 39 درجة مئوية20. في هذه المقالة، نقوم بوصف بروتوكول لإعادة برمجة PBMNCs إلى iNSCs باستخدام نظام SeV.

وقد ذكرت العديد من الدراسات اشتقاق الخلايا العصبية DA من ESCs الإنسان أو iPSCs باستخدام أساليب مختلفة6،8،21. ومع ذلك، هناك نقص في البروتوكولات التي تصف التمايز بين الخلايا العصبية DA من iNSCs في التفاصيل. في هذا البروتوكول، سوف نقوم بوصف الجيل الفعال من الخلايا العصبية DA من iNSCs باستخدام طريقة على مرحلتين. يمكن زرع السلائف العصبية DA في striatum من نماذج الماوس PD لتقييمات السلامة والفعالية. ستقدم هذه المقالة بروتوكول مفصل يغطي مراحل مختلفة من جيل الخلايا الجذعية العصبية المستحثة بفيروس سينداي، تمايز الـ iNSCs في الخلايا العصبية DA، وإنشاء نماذج PD الماوس، إلى زرع سلائف DA في السترياتوم من نماذج PD. باستخدام هذا البروتوكول، يمكن للمرء أن يولد iNSCs من المرضى والمانحين الأصحاء وتستمد الخلايا العصبية DA التي هي آمنة، قابلة للتوحيد القياسي، قابلة للتحجيم ومتجانسة لأغراض زرع الخلايا، أو لنمذجة PD في طبق والتحقيق في الآليات بداية المرض الكامنة والتنمية.

Protocol

ويجب أن تتبع جميع الإجراءات المبادئ التوجيهية للجنة الأخلاقيات المؤسسية للبحوث البشرية. يجب الحصول على موافقة مستنيرة من المرضى أو المتطوعين الأصحاء قبل جمع الدم. وقد وافقت لجنة أخلاقيات البحوث البشرية التابعة للمؤسسة على هذا البروتوكول، وتم تنفيذه وفقاً للمبادئ التوجيهية للمؤسسة المت…

Representative Results

هنا، نقوم بالإبلاغ عن بروتوكول يغطي مراحل مختلفة من العلاج الخلوي iNSC-DA لعلاج نماذج PD. أولاً، تم عزل مركبات ثنائي الفينيل متعدد البروم وتوسيعها، وإعادة برمجتها لتصبح من الـ iNSCs عن طريق عدوى الـ SeV. ويرد في الشكل 1تمثيل تخطيطي للإجراءات مع توسيع PBMNC وتحريض iNSC. وفي اليوم -14، تم ع?…

Discussion

هنا قدمنا بروتوكول التي غطت مراحل مختلفة من العلاج الخلوي iNSC-DA لنماذج PD. وتشمل الجوانب الحاسمة لهذا البروتوكول ما يلي: (1) عزل وتوسيع مركبات ثنائي الفينيل متعدد البروم، وإعادة برمجة مركبات ثنائي الفينيل متعدد البروم في النفثالينات المتعددة البروم على النفثالينات المتعددة الأطراف عن طريق ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

تم دعم العمل من خلال المنح التالية: الخلية الجذعية والترجمة المشروع الرئيسي الوطني (2016YFA0101403)، المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (81661130160، 81422014، 81561138004)، مؤسسة بكين البلدية للعلوم الطبيعية (5142005)، مؤسسة بكين للمواهب (201700021223TD03)، مشروع دعم المعلمين رفيعي المستوى في جامعات بلدية بكين في فترة الخطة الخمسية الثالثة عشرة (CIT & TCD20180333)، جائزة بكين للمواهب ذات المستوى العالي (2015-3-063)، بكين صندوق لجنة الصحة البلدية (PXM 2018_026283_000002)، صندوق بكين 100،000 و10000 مواهب (2018A03)، إدارة بلدية بكين لتطوير الطب السريري من دعم التمويل الخاص (ZYLX201706)، و الزمالة المتقدمة للجمعية الملكية – نيوتن (NA150482).

Materials

15-ml conical tube Corning 430052
1-Thioglycerol Sigma-Aldrich M6145 Toxic for inhalation and skin contact
24-well plate Corning 3337
50-ml conical tube  Corning 430828
6-OHDA Sigma-Aldrich H4381
6-well plate Corning 3516
Accutase Invitrogen A11105-01 Cell dissociation reagent
Apomorphine Sigma-Aldrich A4393
Ascorbic acid Sigma-Aldrich A92902 Toxic with skin contact 
B27 supplement  Invitrogen 17504044
BDNF Peprotech 450-02 Brain derived neurotrophic factor
Blood collection tubes containing sodium heparin BD 367871
BSA yisheng 36106es60 Fetal bovine serum
cAMP Sigma-Aldrich D0627 Dibutyryladenosine cyclic monophosphate
CellBanker 2 ZENOAQ 100ml Used as freezing medium for PBMNCs
Chemically defined lipid concentrate Invitrogen 11905031
CHIR99021 Gene Operation 04-0004
Coverslip Fisher 25*25-2
DAPI Sigma-Aldrich D8417-10mg
DAPT Sigma-Aldrich D5942
Dexamethasone Sigma-Aldrich D2915-100MG
DMEM-F12 Gibco 11330
DMEM-F12 Gibco 11320
Donkey serum Jackson 017-000-121
EPO Peprotech 100-64-50UG Human Erythropoietin
FGF8b Peprotech 100-25
Ficoll-Paque Premium GE Healthcare 17-5442-02 P=1.077, density gradient medium
GDNF Peprotech 450-10 Glial derived neurotrophic factor
GlutaMAX Invitrogen 21051024 100 × Glutamine stock solution
Ham's-F12 Gibco 11765-054
HBSS Invitrogen 14175079 Balanced salt solution
Human leukemia inhibitory factor Millpore LIF1010
Human recombinant SCF Peprotech 300-07-100UG
IGF-1 Peprotech 100-11-100UG Human insulin-like growth factor 
IL-3 Peprotech 200-03-10UG Human interleukin 3
IMDM Gibco 215056-023 Iscove's modified Dulbecco's medium
Insulin Roche  12585014
ITS-X Invitrogen 51500-056 Insulin-transferrin-selenium-X supplement
Knockout serum replacement Gibco 10828028 Serum free basal medium
Laminin Roche  11243217001
Microsyringe Hamilton 7653-01
N2 supplement  Invitrogen 17502048
NEAA Invitrogen 11140050 Non-essential amino acid
Neurobasal Gibco 10888 Basic medium
PDL Sigma-Aldrich P7280 Poly-D-lysine
SAG1 Enzo ALX-270-426-M01
SB431542 Gene Operation 04-0010-10mg Store from light at -20℃
Sendai virus Life Technologies MAN0009378
Sucrose baiaoshengke
TGFβⅢ Peprotech 100-36E Transforming growth factor  βⅢ
Transferrin R&D Systems 2914-HT-100G
Triton X 100 baiaoshengke Nonionic surfactant
Trypan blue Gibco T10282
Xylazine Sigma-Aldrich X1126

References

  1. Williams-Gray, C. H., et al. The distinct cognitive syndromes of Parkinson’s disease: 5 year follow-up of the CamPaIGN cohort. Brain. 132, 2958-2969 (2009).
  2. Dexter, D. T., Jenner, P. Parkinson disease: from pathology to molecular disease mechanisms. Free Radical Biology and Medicine. 62, 132-144 (2013).
  3. Chen, Z. Cell Therapy for Parkinson’s Disease: New Hope from Reprogramming Technologies. Aging and Disease. 6 (6), 499-503 (2015).
  4. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  5. Doi, D., et al. Isolation of human induced pluripotent stem cell-derived dopaminergic progenitors by cell sorting for successful transplantation. Stem Cell Reports. 2 (3), 337-350 (2014).
  6. Kriks, S., et al. Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson’s disease. Nature. 480 (7378), 547-551 (2011).
  7. Perrier, A. L., et al. Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (34), 12543-12548 (2004).
  8. Kikuchi, T., et al. Human iPS cell-derived dopaminergic neurons function in a primate Parkinson’s disease model. Nature. 548 (7669), 592-596 (2017).
  9. Ma, T., Xie, M., Laurent, T., Ding, S. Progress in the reprogramming of somatic cells. Circulation Research. 112 (3), 562-574 (2013).
  10. Tang, X., et al. Conversion of adult human peripheral blood mononuclear cells into induced neural stem cell by using episomal vectors. Stem Cell Research. 16 (2), 236-242 (2016).
  11. Yuan, Y., et al. Dopaminergic precursors differentiated from human blood-derived induced neural stem cells improve symptoms of a mouse Parkinson’s disease model. Theranostics. 8 (17), 4679-4694 (2018).
  12. Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  13. Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nature Biotechnology. 26 (11), 1276-1284 (2008).
  14. Thier, M., et al. Direct conversion of fibroblasts into stably expandable neural stem cells. Cell Stem Cell. 10 (4), 473-479 (2012).
  15. Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures. Nature Protocols. 2 (12), 3081-3089 (2007).
  16. Seki, T., Yuasa, S., Fukuda, K. Generation of induced pluripotent stem cells from a small amount of human peripheral blood using a combination of activated T cells and Sendai virus. Nature Protocols. 7 (4), 718-728 (2012).
  17. Bazley, F. A., et al. Direct Reprogramming of Human Primordial Germ Cells into Induced Pluripotent Stem Cells: Efficient Generation of Genetically Engineered Germ Cells. Stem Cells and Development. 24 (22), 2634-2648 (2015).
  18. Li, H. O., et al. A cytoplasmic RNA vector derived from nontransmissible Sendai virus with efficient gene transfer and expression. Journal of Virology. 74 (14), 6564-6569 (2000).
  19. Sochacki, J., Devalle, S., Reis, M., Mattos, P., Rehen, S. Generation of urine iPS cell lines from patients with Attention Deficit Hyperactivity Disorder (ADHD) using a non-integrative method. Stem Cell Research. 17 (1), 102-106 (2016).
  20. Ban, H., et al. Efficient generation of transgene-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) by temperature-sensitive Sendai virus vectors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (34), 14234-14239 (2011).
  21. Cho, M. S., et al. Highly efficient and large-scale generation of functional dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (9), 3392-3397 (2008).
  22. Dowey, S. N., Huang, X., Chou, B. -. K., Ye, Z., Cheng, L. Generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from postnatal blood mononuclear cells by plasmid vector expression. Nature Protocols. 7 (11), 2013-2021 (2012).
  23. Zhu, S., et al. Reprogramming of human primary somatic cells by OCT4 and chemical compounds. Cell Stem Cell. 7 (6), 651-655 (2010).
  24. Ono, Y., et al. Differences in neurogenic potential in floor plate cells along an anteroposterior location: midbrain dopaminergic neurons originate from mesencephalic floor plate cells. Development. 134 (17), 3213-3225 (2007).
  25. Kirkeby, A., et al. Generation of regionally specified neural progenitors and functional neurons from human embryonic stem cells under defined conditions. Cell Reports. 1 (6), 703-714 (2012).
  26. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
  27. Fasano, C. A., Chambers, S. M., Lee, G., Tomishima, M. J., Studer, L. Efficient derivation of functional floor plate tissue from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 6 (4), 336-347 (2010).
  28. Harvey, B. K., Wang, Y., Hoffer, B. J. Transgenic rodent models of Parkinson’s disease. Acta Neurochirurgica Supplements. 101, 89-92 (2008).
  29. Sheng, C., et al. Generation of dopaminergic neurons directly from mouse fibroblasts and fibroblast-derived neural progenitors. Cell Research. 22 (4), 769-772 (2012).
  30. Prasad, A., et al. A review of induced pluripotent stem cell, direct conversion by trans-differentiation, direct reprogramming and oligodendrocyte differentiation. Regenerative Medicine. 11 (2), 181-191 (2016).

Play Video

Cite This Article
Zheng, W., Chen, Z. Generation of Induced Neural Stem Cells from Peripheral Mononuclear Cells and Differentiation Toward Dopaminergic Neuron Precursors for Transplantation Studies. J. Vis. Exp. (149), e59690, doi:10.3791/59690 (2019).

View Video