Summary

Generazione di cellule staminali neurali indotte da cellule mononucleari periferiche e differenziazione verso i precursori dei neuroni dopaminergici per gli studi di trapianto

Published: July 11, 2019
doi:

Summary

Il protocollo presenta la riprogrammazione delle cellule mononucleari del sangue periferiche per indurre le cellule staminali neurali mediante l’infezione da virus Sendai, la differenziazione degli iNSC in neuroni dopaminergici, il trapianto di precursori DA nei precursori unilateralmente Modelli murini del morbo di Parkinson e valutazione della sicurezza e dell’efficacia dei precursori DA derivati da iNSC per il trattamento con LA PD.

Abstract

Il morbo di Parkinson (PD) è causato dalla degenerazione dei neuroni dopaminergici (DA) alla substantia nigra pars compacta (SNpc) nel mesencephalon ventrale (VM). La terapia sostitutiva cellulare promette molto per il trattamento della PD. Recentemente, le cellule staminali neurali indotte (iNSC) sono emerse come potenziale candidato per la terapia sostitutiva cellulare a causa del ridotto rischio di formazione del tumore e della plasticità di dare origine a neuroni e glia specifici della regione. Gli iNSC possono essere riprogrammati da fonti cellulari somatiche autologhe, come fibroblasti, cellule mononucleari del sangue periferico (PBMCNC) e vari altri tipi di cellule. Rispetto ad altri tipi di celle somatiche, i PBMCC sono un tipo di cellula di partenza accattivante a causa della facilità di accesso ed espansione nella coltura. Il virus Sendai (SeV), un virus RNA non integrativo, che codifica i fattori di riprogrammazione tra cui l’uomo OCT3/4, SOX2, KLF4 e c-MYC, ha un genoma a senso negativo, a filamento singolo e non segmentato che non si integra genoma ospite, ma si replica solo nel citoplasma delle cellule infette, offrendo un veicolo efficiente e sicuro per la riprogrammazione. In questo studio viene descritto un protocollo in cui gli iNSC vengono ottenuti riprogrammando i PBMCNC, e differenziati in neuroni VM DA specializzati con un metodo a due stadi. Poi i precursori DA vengono trapiantati in modelli murini PD a 6-hyroxydopamina (6-OHDA) per valutare la sicurezza e l’efficacia per il trattamento della PD. Questo metodo fornisce una piattaforma per studiare le funzioni e gli effetti terapeutici delle cellule neurali DA specifiche del paziente in vitro e in vivo.

Introduction

Il morbo di Parkinson (PD) è un disturbo neurodegenerativo comune, causato dalla degenerazione dei neuroni dopaminergici (DA) alla substantia nigra pars compacta (SNpc) nella mesincephalon ventrale (VM), con una prevalenza di oltre l’1% della popolazione sopra i 60 anni di età 1 : il nome del , 2. Nell’ultimo decennio, la terapia cellulare, volta a sostituire le cellule degenerative o danneggiate, o a nutrire il microambiente intorno ai neuroni degeneranti, ha mostrato un potenziale nel trattamento della PD3. Nel frattempo, la tecnologia di riprogrammazione ha fatto progressi significativi4, che fornisce una fonte cellulare promettente per la terapia sostitutiva. Le cellule staminali pluripotenti indotte dall’uomo (iPSC) e le cellule staminali embrionali (ESC) hanno dimostrato di essere in grado di differenziarsi nelle cellule neurali DA, che potrebbero sopravvivere, maturarsi e migliorare le funzioni motorie quando innestate nei modelli di PD di ratti e primati non umani5 ,6,7,8. Gli iPSC rappresentano una pietra miliare nelle tecnologie di riprogrammazione cellulare e hanno un grande potenziale nel trapianto di cellule; tuttavia, c’è ancora una preoccupazione circa il rischio di formazione del tumore dalle cellule incompletamente differenziate. Una fonte cellulare alternativa per il trapianto di cellule è costituita da cellule staminali adulte impegnate nel lignaggio ottenute attraverso la riprogrammazione diretta, come le cellule staminali neurali indotte (iNSC), che possono essere derivate dagli intermedi instabili, bypassando la pluripotenza fase9,10,11.

Sia gli iPSC che gli iNSC possono essere riprogrammati da fonti cellulari autologhe, come fibroblasti, cellule mononucleari del sangue periferico (PBMCNC) e vari altri tipi di cellule12,13,14, riducendo così la immunogenicità delle cellule trapiantate in gran parte. Inoltre, rispetto agli iPSC, gli iNSC sono intrinseci con ridotto rischio di formazione del tumore e plasticità impegnata nel lignaggio, solo in grado di differenziarsi in neuroni e glia11. Negli studi iniziali, iPSC umani o topi e iNSC sono stati generati da fibroblasti ottenuti da biopsie cutanee, che è una procedura invasiva14,15. A questo proposito, i PBMNC Sono una fonte di cellule di partenza attraente a causa del processo di campionamento meno invasivo e della facilità di ottenere un gran numero di cellule entro un breve periodo di tempo di espansione16. Gli studi iniziali di riprogrammazione hanno impiegato sistemi di erogazione integrativi, come vettori lentivirali o retrovirali, che sono efficienti e facili da implementare in molti tipi di cellule17; tuttavia, questi sistemi di somministrazione possono causare mutazioni e riattivazione di transgeni residui, che presentano problemi di sicurezza per scopi terapeutici clinici12. Il virus Sendai (SeV) è un virus RNA non integrativo con un genoma a singolo filamento negativo che non si integra nel genoma dell’ospite, ma si replica solo nel citoplasma delle cellule infette, offrendo un veicolo efficiente e sicuro per la riprogrammazione18 ,19. Sono disponibili vettori SeV ricombinanti che contengono fattori di riprogrammazione, tra cui l’oggetto OCT3/4, SOX2, KLF4 e c-MYC nei frame di lettura aperti. Inoltre, i vettori virali SeV possono essere ulteriormente migliorati introducendo mutazioni sensibili alla temperatura, inmodo che possano essere rapidamente rimossi quando la temperatura di coltura viene aumentata a 39 . In questo articolo viene descritto un protocollo per riprogrammare i PBMNN in iNSC utilizzando il sistema SeV.

Molti studi hanno riportato la derivazione di neuroni DA da ESC umani o iPSC utilizzando vari metodi6,8,21. Tuttavia, c’è una carenza di protocolli che descrivono la differenziazione dei neuroni DA da iNSC nei dettagli. In questo protocollo, descriveremo la generazione efficiente di neuroni DA da iNSC utilizzando un metodo a due stadi. I precursori neuronali DA possono essere trapiantati nello striato dei modelli murini della PD per le valutazioni di sicurezza ed efficacia. Questo articolo presenterà un protocollo dettagliato che copre varie fasi dalla generazione di cellule staminali neurali indotte dal virus Sendai, la differenziazione di iNSC in neuroni DA, la creazione di modelli di PD murino, al trapianto di precursori DA nello striato dei modelli PD. Utilizzando questo protocollo, si possono generare iNSC da pazienti e donatori sani e derivare neuroni DA sicuri, standardizzati, scalabili e omogenei ai fini del trapianto di cellule, o per la modellazione della PD in un piatto e lo studio dei meccanismi l’insorgenza e lo sviluppo della malattia sottostante.

Protocol

Tutte le procedure devono seguire le linee guida del comitato etico istituzionale per la ricerca umana. Il consenso informato deve essere ottenuto da pazienti o volontari sani prima della raccolta del sangue. Questo protocollo è stato approvato dal comitato etico della ricerca umana dell’istituzione ed è stato eseguito secondo le linee guida dell’istituzione per la cura e l’uso degli animali. 1. Raccolta, isolamento ed espansione di PBMNC Raccolta di PBMNC <l…

Representative Results

Qui, segnaliamo un protocollo che copre le diverse fasi della terapia cellulare iNSC-DA per il trattamento dei modelli PD. In primo luogo, i PBMNC sono stati isolati e ampliati e riprogrammati in iNSC dall’infezione da SeV. Nella figura 1è illustrata una rappresentazione schematica delle procedure con espansione PBMNC e induzione iNSC. Il giorno -14, i PBMNC sono stati isolati utilizzando un supporto di sfumatura di densità (Tabella dei materiali). Prima della centrifuga, …

Discussion

Qui abbiamo presentato un protocollo che ha coperto diverse fasi della terapia cellulare iNSC-DA per i modelli PD. Gli aspetti critici di questo protocollo includono: (1) isolamento e espansione dei PBMCNC e riprogrammazione dei PBMCNC in iNSC mediante infezione da SeV, (2) differenziazione degli iNSC ai neuroni DA, (3) creazione di modelli murini PD unilaterali 6-OHDA-lesioned e (4) il trapianto di cellule dei precursori da DA e la valutazione comportamentale.

In questo protocollo, la prima p…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Il lavoro è stato sostenuto dalle seguenti sovvenzioni: Stem Cell and Translation National Key Project (2016YFA010101403), National Natural Science Foundation of China (81661130160, 81422014, 815611138004), Beijing Municipal Natural Science Foundation (5142005), Beijing Talents Foundation (2017000021223TD03), Progetto di sostegno degli insegnanti di alto livello nelle università comunali di Pechino nel periodo del tredicesimo piano quinquennale (CIT e TCD2018033), Beijing Medical System High Level Talent Award (2015-3-063), Pechino Fondo della Commissione Sanitaria Comunale (PXM 2018_026283_000002), Beijing One Hundred, Thousand, and Ten Ten Thousand Talents Fund (2018A03), Amministrazione Municipale di Medicina Clinica degli Ospedali Sviluppo di Sostegno Royal Society-Newton Advanced Fellowship (NA150482).

Materials

15-ml conical tube Corning 430052
1-Thioglycerol Sigma-Aldrich M6145 Toxic for inhalation and skin contact
24-well plate Corning 3337
50-ml conical tube  Corning 430828
6-OHDA Sigma-Aldrich H4381
6-well plate Corning 3516
Accutase Invitrogen A11105-01 Cell dissociation reagent
Apomorphine Sigma-Aldrich A4393
Ascorbic acid Sigma-Aldrich A92902 Toxic with skin contact 
B27 supplement  Invitrogen 17504044
BDNF Peprotech 450-02 Brain derived neurotrophic factor
Blood collection tubes containing sodium heparin BD 367871
BSA yisheng 36106es60 Fetal bovine serum
cAMP Sigma-Aldrich D0627 Dibutyryladenosine cyclic monophosphate
CellBanker 2 ZENOAQ 100ml Used as freezing medium for PBMNCs
Chemically defined lipid concentrate Invitrogen 11905031
CHIR99021 Gene Operation 04-0004
Coverslip Fisher 25*25-2
DAPI Sigma-Aldrich D8417-10mg
DAPT Sigma-Aldrich D5942
Dexamethasone Sigma-Aldrich D2915-100MG
DMEM-F12 Gibco 11330
DMEM-F12 Gibco 11320
Donkey serum Jackson 017-000-121
EPO Peprotech 100-64-50UG Human Erythropoietin
FGF8b Peprotech 100-25
Ficoll-Paque Premium GE Healthcare 17-5442-02 P=1.077, density gradient medium
GDNF Peprotech 450-10 Glial derived neurotrophic factor
GlutaMAX Invitrogen 21051024 100 × Glutamine stock solution
Ham's-F12 Gibco 11765-054
HBSS Invitrogen 14175079 Balanced salt solution
Human leukemia inhibitory factor Millpore LIF1010
Human recombinant SCF Peprotech 300-07-100UG
IGF-1 Peprotech 100-11-100UG Human insulin-like growth factor 
IL-3 Peprotech 200-03-10UG Human interleukin 3
IMDM Gibco 215056-023 Iscove's modified Dulbecco's medium
Insulin Roche  12585014
ITS-X Invitrogen 51500-056 Insulin-transferrin-selenium-X supplement
Knockout serum replacement Gibco 10828028 Serum free basal medium
Laminin Roche  11243217001
Microsyringe Hamilton 7653-01
N2 supplement  Invitrogen 17502048
NEAA Invitrogen 11140050 Non-essential amino acid
Neurobasal Gibco 10888 Basic medium
PDL Sigma-Aldrich P7280 Poly-D-lysine
SAG1 Enzo ALX-270-426-M01
SB431542 Gene Operation 04-0010-10mg Store from light at -20℃
Sendai virus Life Technologies MAN0009378
Sucrose baiaoshengke
TGFβⅢ Peprotech 100-36E Transforming growth factor  βⅢ
Transferrin R&D Systems 2914-HT-100G
Triton X 100 baiaoshengke Nonionic surfactant
Trypan blue Gibco T10282
Xylazine Sigma-Aldrich X1126

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Cite This Article
Zheng, W., Chen, Z. Generation of Induced Neural Stem Cells from Peripheral Mononuclear Cells and Differentiation Toward Dopaminergic Neuron Precursors for Transplantation Studies. J. Vis. Exp. (149), e59690, doi:10.3791/59690 (2019).

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