Summary

Поколение индуцированных нейронных стволовых клеток из периферических моноядерных клеток и дифференциация к дофаминергическим нейронным прекурсорам для трансплантационных исследований

Published: July 11, 2019
doi:

Summary

Протокол представляет перепрограммирование периферических моноядерных клеток крови, чтобы вызвать нервные стволовые клетки путем инфекции вируса Сендай, дифференциация iNSCs в дофаминергические нейроны, трансплантация прекурсоров DA в одностороннем-пораженных Болезнь Паркинсона мыши модели, и оценка безопасности и эффективности iNSC полученных dA предшественников для лечения PD.

Abstract

Болезнь Паркинсона (PD) вызвана дегенерацией дофаминергических (DA) нейронов на substantia nigra pars compacta (SNpc) в брюшной мезенцефалон (VM). Клеточная заместительная терапия имеет большие перспективы для лечения PD. В последнее время, индуцированных нервных стволовых клеток (iNSCs) стали потенциальным кандидатом на клеточной заместительной терапии из-за снижения риска образования опухоли и пластичности, чтобы привести к региона конкретных нейронов и глии. iNSCs могут быть перепрограммированы из аутологических соматических клеточных источников, таких как фибробласты, периферийные моноядерные клетки крови (ПБМНК) и различные другие типы клеток. По сравнению с другими типами соматических клеток, PBMNCs являются привлекательным типом стартерных клеток из-за легкости доступа и расширения в культуре. Сендай вирус (SeV), РНК неинтегративного вируса, кодирование факторов перепрограммирования, включая человека OCT3/4, SOX2, KLF4 и c-MYC, имеет отрицательный смысл, одноцепочечный, несегментированный геном, который не интегрируется в геном хозяина, но только реплицируется в цитоплазме инфицированных клеток, предлагая эффективный и безопасный инструмент для перепрограммирования. В этом исследовании мы описываем протокол, в котором iNSCs получают путем перепрограммирования PBMNCs, и дифференцированы в специализированные нейроны VM DA двухступенчатым методом. Затем прекурсоры DA пересаживаются в одностороннем порядке 6-hyroxydopamine (6-OHDA) -пораженные модели мыши PD для оценки безопасности и эффективности для лечения PD. Этот метод предоставляет платформу для изучения функций и терапевтических эффектов пациентов конкретных DA нейронных клеток in vitro и in vivo.

Introduction

Болезнь Паркинсона (PD) является распространенным нейродегенеративным расстройством, вызванным дегенерацией дофаминергических (DA) нейронов на substantia nigra pars compacta (SNpc) в вентральном мезенефалионе (VM), с преобладанием более 1% у населения старше 60 лет 1 , 2. За последнее десятилетие, клеточная терапия, направленная либо на замену дегенеративных или поврежденных клеток, или питание микросреды вокруг вырождающихся нейронов, показал потенциал в лечении PD3. Между тем, технология перепрограммирования добилась значительного прогресса4, который обеспечивает перспективный клеточный источник для заместительной терапии. Было доказано, что индуцированные человеком плюрипотентные стволовые клетки (iPSCs) и эмбриональные стволовые клетки (ESCs) способны дифференцироваться в нервные клетки DA, которые могут выживать, maturate и улучшать двигательные функции при привитом крысиных и нечеловеческих моделей PD ,6,7,8. iPSCs представляют собой веху в клеточных технологиях перепрограммирования и имеют большой потенциал в трансплантации клеток; однако, все еще забота о риске образования тумора от неполно дифференцированных клеток. Альтернативным клеточным источником для трансплантации клеток является линия- совершенных взрослых стволовых клеток, полученных путем прямого перепрограммирования, таких как индуцированные нервные стволовые клетки (iNSCs), которые могут быть получены из нестабильных промежуточных, в обход плюрипотентности этап9,10,11.

Как iPSCs, так и iNSCs могут быть перепрограммированы из аутологичных клеточных источников, таких как фибробласты, периферийные моноядерные клетки крови (ПБМНК) и различные другие типы клеток12,13,14, тем самым уменьшая иммуногенности пересаженных клеток в значительной степени. Кроме того, по сравнению с iPSCs, iNSCs присущи снижение риска образования опухоли и линии, совершенные пластичности, только в состоянии дифференцировать в нейроны и глия11. В первоначальных исследованиях, человека или мыши iPSCs и iNSCs были созданы из фибробластов, полученных из биопсии кожи, которая является инвазивной процедурой14,15. С этим уважением, PBMNCs являются привлекательным источником стартер ячейки из-за менее инвазивного процесса отбора проб, и легкость для получения большого количества клеток в течение короткого периода времени расширения16. Первоначальные исследования перепрограммирования использовали интегративные системы доставки, такие как лентивирусные или ретровирусные векторы, которые являются эффективными и простыми в реализации во многих типах клеток17; однако, эти системы доставки могут вызвать мутации и реактивацию остаточных трансгенов, которые представляют проблемы безопасности для клинических терапевтических целей12. Вирус Сендай (SeV) является неинтегративным РНК-вирус омовением с отрицательным смыслом, одноцепочечным геномом, который не интегрируется в геном хозяина, а только размножается в цитоплазме инфицированных клеток, предлагая эффективный и безопасный инструмент для перепрограммирования18 ,19. Рекомбинантные векторы SeV доступны, которые содержат факторы перепрограммирования, включая человека OCT3/4, SOX2, KLF4 и c-MYC в их открытых кадрах чтения. Кроме того, seV вирусные векторы могут быть дополнительно улучшены путем введения чувствительных к температуре мутаций, так что они могут быть быстро удалены, когда температура культуры поднимается до 39 градусов по Цельсию20. В этой статье мы описываем протокол перепрограммирования PBMNCs на iNSCs с помощью системы SeV.

Многие исследования сообщили вывод dA нейронов от человека ESCs илиiPSCs с использованием различных методов 6,8,21. Тем не менее, существует нехватка протоколов, описывающих дифференциацию нейронов DA от iNSCs в деталях. В этом протоколе мы опишите эффективное генерирующее нейроны DA из iNSCs с помощью двухэтапного метода. Предшественники нейронов DA могут быть пересажены в стриатум моделей PD мыши для оценки безопасности и эффективности. В этой статье будет представлен подробный протокол, который охватывает различные этапы от генерации индуцированных нервных стволовых клеток вирусом Сендай, дифференциация iNSCs в DA нейронов, создание мыши PD модели, для трансплантации прекурсоров DA в стриатума моделей PD. Используя этот протокол, можно генерировать iNSCs от пациентов и здоровых доноров и получить DA нейронов, которые являются безопасными, стандартизируемыми, масштабируемыми и однородными для клеточной трансплантации целей, или для моделирования PD в тарелке и исследования механизмов основного заболевания и развития.

Protocol

Все процедуры должны следовать руководящим принципам институционального комитета по этике исследований человека. Информированное согласие должно быть получено от пациентов или здоровых добровольцев до сбора крови. Этот протокол был одобрен комитетом по этике исследований человека …

Representative Results

Здесь мы сообщаем протокол, который охватывает различные этапы клеточной терапии iNSC-DA для лечения моделей PD. Во-первых, ПБМНК были изолированы и расширены, и перепрограммированы в iNSCs инфекцией SeV. Схематическое представление процедур с расширением PBMNC и индукцией iNSC показано на рисунке…

Discussion

Здесь мы представили протокол, который охватывает различные этапы iNSC-DA клеточной терапии для моделей PD. Критические аспекты этого протокола включают: (1) изоляция и расширение ПБМНК и перепрограммирование ПБМНК в iNSCs с помощью инфекции SeV, (2) дифференциация iNSCs для нейронов DA, (3) создание ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Работа была поддержана следующими грантами: Проект стволовых клеток и переводов (2016YFA0101403), Национальный фонд естественных наук Китая (81661130160, 81422014, 81561138004), Пекинский муниципальный фонд естественных наук (5142005), Пекин таланты Фонда (20170000212223TD03), Поддержка проекта высокого уровня учителей в Пекинских муниципальных университетов в период 13-й пятилетний план (CIT и TCD20180333), Пекинская медицинская система высокого уровня талант премии (2015-3-063), Пекин Муниципальный фонд Комиссии по здравоохранению (PXM 2018-026283-000002), Пекин Сто, тысяча и десять тысяч талантов фонда (2018A03), Пекинское муниципальное управление больниц клинической медицины Развития специальной финансовой поддержки (YLX201706), и Королевское общество-Ньютон Расширенный стипендий (NA150482).

Materials

15-ml conical tube Corning 430052
1-Thioglycerol Sigma-Aldrich M6145 Toxic for inhalation and skin contact
24-well plate Corning 3337
50-ml conical tube  Corning 430828
6-OHDA Sigma-Aldrich H4381
6-well plate Corning 3516
Accutase Invitrogen A11105-01 Cell dissociation reagent
Apomorphine Sigma-Aldrich A4393
Ascorbic acid Sigma-Aldrich A92902 Toxic with skin contact 
B27 supplement  Invitrogen 17504044
BDNF Peprotech 450-02 Brain derived neurotrophic factor
Blood collection tubes containing sodium heparin BD 367871
BSA yisheng 36106es60 Fetal bovine serum
cAMP Sigma-Aldrich D0627 Dibutyryladenosine cyclic monophosphate
CellBanker 2 ZENOAQ 100ml Used as freezing medium for PBMNCs
Chemically defined lipid concentrate Invitrogen 11905031
CHIR99021 Gene Operation 04-0004
Coverslip Fisher 25*25-2
DAPI Sigma-Aldrich D8417-10mg
DAPT Sigma-Aldrich D5942
Dexamethasone Sigma-Aldrich D2915-100MG
DMEM-F12 Gibco 11330
DMEM-F12 Gibco 11320
Donkey serum Jackson 017-000-121
EPO Peprotech 100-64-50UG Human Erythropoietin
FGF8b Peprotech 100-25
Ficoll-Paque Premium GE Healthcare 17-5442-02 P=1.077, density gradient medium
GDNF Peprotech 450-10 Glial derived neurotrophic factor
GlutaMAX Invitrogen 21051024 100 × Glutamine stock solution
Ham's-F12 Gibco 11765-054
HBSS Invitrogen 14175079 Balanced salt solution
Human leukemia inhibitory factor Millpore LIF1010
Human recombinant SCF Peprotech 300-07-100UG
IGF-1 Peprotech 100-11-100UG Human insulin-like growth factor 
IL-3 Peprotech 200-03-10UG Human interleukin 3
IMDM Gibco 215056-023 Iscove's modified Dulbecco's medium
Insulin Roche  12585014
ITS-X Invitrogen 51500-056 Insulin-transferrin-selenium-X supplement
Knockout serum replacement Gibco 10828028 Serum free basal medium
Laminin Roche  11243217001
Microsyringe Hamilton 7653-01
N2 supplement  Invitrogen 17502048
NEAA Invitrogen 11140050 Non-essential amino acid
Neurobasal Gibco 10888 Basic medium
PDL Sigma-Aldrich P7280 Poly-D-lysine
SAG1 Enzo ALX-270-426-M01
SB431542 Gene Operation 04-0010-10mg Store from light at -20℃
Sendai virus Life Technologies MAN0009378
Sucrose baiaoshengke
TGFβⅢ Peprotech 100-36E Transforming growth factor  βⅢ
Transferrin R&D Systems 2914-HT-100G
Triton X 100 baiaoshengke Nonionic surfactant
Trypan blue Gibco T10282
Xylazine Sigma-Aldrich X1126

References

  1. Williams-Gray, C. H., et al. The distinct cognitive syndromes of Parkinson’s disease: 5 year follow-up of the CamPaIGN cohort. Brain. 132, 2958-2969 (2009).
  2. Dexter, D. T., Jenner, P. Parkinson disease: from pathology to molecular disease mechanisms. Free Radical Biology and Medicine. 62, 132-144 (2013).
  3. Chen, Z. Cell Therapy for Parkinson’s Disease: New Hope from Reprogramming Technologies. Aging and Disease. 6 (6), 499-503 (2015).
  4. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  5. Doi, D., et al. Isolation of human induced pluripotent stem cell-derived dopaminergic progenitors by cell sorting for successful transplantation. Stem Cell Reports. 2 (3), 337-350 (2014).
  6. Kriks, S., et al. Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson’s disease. Nature. 480 (7378), 547-551 (2011).
  7. Perrier, A. L., et al. Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (34), 12543-12548 (2004).
  8. Kikuchi, T., et al. Human iPS cell-derived dopaminergic neurons function in a primate Parkinson’s disease model. Nature. 548 (7669), 592-596 (2017).
  9. Ma, T., Xie, M., Laurent, T., Ding, S. Progress in the reprogramming of somatic cells. Circulation Research. 112 (3), 562-574 (2013).
  10. Tang, X., et al. Conversion of adult human peripheral blood mononuclear cells into induced neural stem cell by using episomal vectors. Stem Cell Research. 16 (2), 236-242 (2016).
  11. Yuan, Y., et al. Dopaminergic precursors differentiated from human blood-derived induced neural stem cells improve symptoms of a mouse Parkinson’s disease model. Theranostics. 8 (17), 4679-4694 (2018).
  12. Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  13. Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nature Biotechnology. 26 (11), 1276-1284 (2008).
  14. Thier, M., et al. Direct conversion of fibroblasts into stably expandable neural stem cells. Cell Stem Cell. 10 (4), 473-479 (2012).
  15. Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures. Nature Protocols. 2 (12), 3081-3089 (2007).
  16. Seki, T., Yuasa, S., Fukuda, K. Generation of induced pluripotent stem cells from a small amount of human peripheral blood using a combination of activated T cells and Sendai virus. Nature Protocols. 7 (4), 718-728 (2012).
  17. Bazley, F. A., et al. Direct Reprogramming of Human Primordial Germ Cells into Induced Pluripotent Stem Cells: Efficient Generation of Genetically Engineered Germ Cells. Stem Cells and Development. 24 (22), 2634-2648 (2015).
  18. Li, H. O., et al. A cytoplasmic RNA vector derived from nontransmissible Sendai virus with efficient gene transfer and expression. Journal of Virology. 74 (14), 6564-6569 (2000).
  19. Sochacki, J., Devalle, S., Reis, M., Mattos, P., Rehen, S. Generation of urine iPS cell lines from patients with Attention Deficit Hyperactivity Disorder (ADHD) using a non-integrative method. Stem Cell Research. 17 (1), 102-106 (2016).
  20. Ban, H., et al. Efficient generation of transgene-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) by temperature-sensitive Sendai virus vectors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (34), 14234-14239 (2011).
  21. Cho, M. S., et al. Highly efficient and large-scale generation of functional dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (9), 3392-3397 (2008).
  22. Dowey, S. N., Huang, X., Chou, B. -. K., Ye, Z., Cheng, L. Generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from postnatal blood mononuclear cells by plasmid vector expression. Nature Protocols. 7 (11), 2013-2021 (2012).
  23. Zhu, S., et al. Reprogramming of human primary somatic cells by OCT4 and chemical compounds. Cell Stem Cell. 7 (6), 651-655 (2010).
  24. Ono, Y., et al. Differences in neurogenic potential in floor plate cells along an anteroposterior location: midbrain dopaminergic neurons originate from mesencephalic floor plate cells. Development. 134 (17), 3213-3225 (2007).
  25. Kirkeby, A., et al. Generation of regionally specified neural progenitors and functional neurons from human embryonic stem cells under defined conditions. Cell Reports. 1 (6), 703-714 (2012).
  26. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
  27. Fasano, C. A., Chambers, S. M., Lee, G., Tomishima, M. J., Studer, L. Efficient derivation of functional floor plate tissue from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 6 (4), 336-347 (2010).
  28. Harvey, B. K., Wang, Y., Hoffer, B. J. Transgenic rodent models of Parkinson’s disease. Acta Neurochirurgica Supplements. 101, 89-92 (2008).
  29. Sheng, C., et al. Generation of dopaminergic neurons directly from mouse fibroblasts and fibroblast-derived neural progenitors. Cell Research. 22 (4), 769-772 (2012).
  30. Prasad, A., et al. A review of induced pluripotent stem cell, direct conversion by trans-differentiation, direct reprogramming and oligodendrocyte differentiation. Regenerative Medicine. 11 (2), 181-191 (2016).

Play Video

Cite This Article
Zheng, W., Chen, Z. Generation of Induced Neural Stem Cells from Peripheral Mononuclear Cells and Differentiation Toward Dopaminergic Neuron Precursors for Transplantation Studies. J. Vis. Exp. (149), e59690, doi:10.3791/59690 (2019).

View Video