Поколение индуцированных нейронных стволовых клеток из периферических моноядерных клеток и дифференциация к дофаминергическим нейронным прекурсорам для трансплантационных исследований

Болезнь Паркинсона (PD) является распространенным нейродегенеративным расстройством, вызванным дегенерацией дофаминергических (DA) нейронов на substantia nigra pars compacta (SNpc) в вентральном мезенефалионе (VM), с преобладанием более 1% у населения старше 60 лет ^{1 , 2}. За последнее десятилетие, клеточная терапия, направленная либо на замену дегенеративных или поврежденных клеток, или питание микросреды вокруг вырождающихся нейронов, показал потенциал в лечении PD³. Между тем, технология перепрограммирования добилась значительного прогресса⁴, который обеспечивает перспективный клеточный источник для заместительной терапии. Было доказано, что индуцированные человеком плюрипотентные стволовые клетки (iPSCs) и эмбриональные стволовые клетки (ESCs) способны дифференцироваться в нервные клетки DA, которые могут выживать, maturate и улучшать двигательные функции при привитом крысиных и нечеловеческих моделей PD ^,6,^7,8. iPSCs представляют собой веху в клеточных технологиях перепрограммирования и имеют большой потенциал в трансплантации клеток; однако, все еще забота о риске образования тумора от неполно дифференцированных клеток. Альтернативным клеточным источником для трансплантации клеток является линия- совершенных взрослых стволовых клеток, полученных путем прямого перепрограммирования, таких как индуцированные нервные стволовые клетки (iNSCs), которые могут быть получены из нестабильных промежуточных, в обход плюрипотентности этап^9,10,11.

Как iPSCs, так и iNSCs могут быть перепрограммированы из аутологичных клеточных источников, таких как фибробласты, периферийные моноядерные клетки крови (ПБМНК) и различные другие типы клеток^12,13,14, тем самым уменьшая иммуногенности пересаженных клеток в значительной степени. Кроме того, по сравнению с iPSCs, iNSCs присущи снижение риска образования опухоли и линии, совершенные пластичности, только в состоянии дифференцировать в нейроны и глия¹¹. В первоначальных исследованиях, человека или мыши iPSCs и iNSCs были созданы из фибробластов, полученных из биопсии кожи, которая является инвазивной процедурой^14,15. С этим уважением, PBMNCs являются привлекательным источником стартер ячейки из-за менее инвазивного процесса отбора проб, и легкость для получения большого количества клеток в течение короткого периода времени расширения¹⁶. Первоначальные исследования перепрограммирования использовали интегративные системы доставки, такие как лентивирусные или ретровирусные векторы, которые являются эффективными и простыми в реализации во многих типах клеток^17; однако, эти системы доставки могут вызвать мутации и реактивацию остаточных трансгенов, которые представляют проблемы безопасности для клинических терапевтических целей^12. Вирус Сендай (SeV) является неинтегративным РНК-вирус омовением с отрицательным смыслом, одноцепочечным геномом, который не интегрируется в геном хозяина, а только размножается в цитоплазме инфицированных клеток, предлагая эффективный и безопасный инструмент для перепрограммирования^{18 ,19}. Рекомбинантные векторы SeV доступны, которые содержат факторы перепрограммирования, включая человека OCT3/4, SOX2, KLF4 и c-MYC в их открытых кадрах чтения. Кроме того, seV вирусные векторы могут быть дополнительно улучшены путем введения чувствительных к температуре мутаций, так что они могут быть быстро удалены, когда температура культуры поднимается до 39 градусов по Цельсию²⁰. В этой статье мы описываем протокол перепрограммирования PBMNCs на iNSCs с помощью системы SeV.

Многие исследования сообщили вывод dA нейронов от человека ESCs илиiPSCs с использованием различных методов 6,^8,21. Тем не менее, существует нехватка протоколов, описывающих дифференциацию нейронов DA от iNSCs в деталях. В этом протоколе мы опишите эффективное генерирующее нейроны DA из iNSCs с помощью двухэтапного метода. Предшественники нейронов DA могут быть пересажены в стриатум моделей PD мыши для оценки безопасности и эффективности. В этой статье будет представлен подробный протокол, который охватывает различные этапы от генерации индуцированных нервных стволовых клеток вирусом Сендай, дифференциация iNSCs в DA нейронов, создание мыши PD модели, для трансплантации прекурсоров DA в стриатума моделей PD. Используя этот протокол, можно генерировать iNSCs от пациентов и здоровых доноров и получить DA нейронов, которые являются безопасными, стандартизируемыми, масштабируемыми и однородными для клеточной трансплантации целей, или для моделирования PD в тарелке и исследования механизмов основного заболевания и развития.