Organidi neurali umani per lo studio del cancro al cervello e delle malattie neurodegenerative

Questo protocollo segue le linee guida del comitato etico della ricerca umana dell’Università di Ginevra. 1. Manutenzione e coltura di cellule staminali embrionali umane indifferenziate (hESC) Esegui la manutenzione e l’espansione degli hSEC in condizioni di liberazione dell’alimentatore pre-rivestimento con una specifica matrice extracellulare. Scongelare 300 l di matrice extracellulare a 4 gradi centigradi (concentrazione tipica della gamma 18-22 mg/mL, tenere sul ghiaccio) e mescolare delicatamente con 15 mL di mezzo DMEM freddo per evitare una gelazione prematura della matrice extracellulare. Aggiungere 7,5 mL dell’extracellulare matrico a entrambi i flaconi T150. Incubare i piatti rivestiti con matrice extracellulare a 37 s per almeno 1 h (massimo durante la notte). Rimuovere gli hESC medi e semi a una densità di 6,5 x 104 celle/cm2. Mantenere H1 (linea cellulare hESC) in hESC medio e 1% penicillina/streptomycin. Passare le cellule con procedura ezimatica: aggiungere 7,5 mL di soluzione ezimatica a un flacone T75 cm2 per un periodo di 1-2 min a 37 gradi centigradi. Una volta che le cellule sono completamente staccate, aggiungere 7,5 mL di DMEM-F12 quindi centrificare per 5 min a 300 x g. Per consentire una migliore sopravvivenza, ri-piastrare le cellule alla densità desiderata su piatti extracellulari rivestiti a matrice, nello stesso mezzo contenente inibitore della chinasi proteica associata al Rho (ROCK) (10 M) per 24 ore. 2. organoidi neurali derivati da hESC per studi GBM 24 h prima di iniziare la coltura 3D, sostituire il mezzo hESC con un mezzo privo di siero integrato con 10 inibitori di ROCK di 10 M (entrambi i componenti sono necessari per sostenere la sopravvivenza delle cellule e la formazione spontanea della neurosfera durante la fase di aggregazione in un microwell piatto). Le cellule devono essere al 60% di confluenza. Il giorno successivo (giorno 0), staccare le colonie hESC come singole cellule: rimuovere il mezzo, quindi risciacquare con PBS senza Ca2 oMg2, aggiungere 5 mL di soluzione di dissoluzione enzimatica e incubare a 37 gradi centigradi per 1-2 min. Raccogliere le cellule in un mezzo privo di siero con 10 M di inibitore ROCK e centrificare le cellule a 300 x g per 5 min. Rimuovere il supernatante e contare le cellule in 10 mL di mezzo senza sieri integrato con 10 M di inibitore ROCK. In parallelo, sciacquare la piastra microwell con 2 mL di mezzo senza sieri per pozzo e centrifugare la piastra a 1200 x g per 5 min per rimuovere tutte le bolle, che possono prevenire la formazione della neurosfera. Preparare 28,2 x 106 cellule in 12,5 mL di mezzo senza sieri integrato con 10 inibitore ROCK m. Distribuisci 1000 cellule/microwell. Centrifugare le cellule a 300 x g per 5 min e posizionare la piastra nell’incubatrice a 37 gradi durante la notte (massimo 36 h). Per esempio: per ottenere 30 organoidi neurali umani, utilizzare una fiaschetta T150 al 70%-80% della confluenza (circa 30 milioni di cellule). Il giorno successivo (giorno 1), raccogliere le sfere (con un P1000) e metterle in un 6 bene piastra. In ogni pozzo, aggiungere 2 mL di B27 medio e DMEM-F12 GlutaMAX e Neurobasal medio (mix a 1:1), integrato con 1% B27 integratori e 1% aminoacidi non essenziali (NEAA). Per promuovere l’induzione neurale veloce, integrare il mezzo con un doppio cocktail di inibizione SMAD, composto da 10 inibitori di TGF/Nodal e inibitore della proteina morfogena dell’osso 0,5 M (BMP). Da questo passo in avanti, le sfere sono coltivate in rotazione (60 rpm, shaker orbitale). La rotazione è fondamentale per evitare che le sfere si attacchino insieme o alla piastra. Cambiare il mezzo ogni 2-3 giorni: piegare la piastra e lasciare cadere le sfere per 5 min, rimuovere metà del mezzo (2 mL), e aggiungere 2 mL di fresco B27 medio integrato con fattori di crescita e inibitori. Non centrifugare le sfere. Eseguire l’induzione neurale in base al seguente corso temporale: Dai giorni 1-4, la cultura le sfere in B27 medio integrato con dual-SMAD. Il doppio cocktail di inibizione sMAD (10 M TGF/Activin/Nodal inibitore e 0,5 M bMP inibitore) promuove l’induzione neurale. Dai giorni 4-11, promuovere la proliferazione di rosette neurali derivate da hESC (nelle sfere), aggiungendo 10 fattore di crescita epidermico ng/mL (EGF) e 10 fattore fibroblasto di base ng/mL (bFGF) al mezzo B27 integrato con cocktail dual-SMAD.NOTA: il giorno 11, la maggior parte delle celle dovrebbe essere positiva per Nestin. Dai giorni 11-13, coltura le sfere in B27 medio integrato con 0,5 M inibitore BMP. Dai giorni 13-21, coltura le sfere in B27 medio integrato con 10 ng/mL gliale fattore neurotrofico derivato (GDNF), 10 ng/mL cervello derivato fattore neurotrofico (BDNF) e 1 M di inibitore di z secretasi. GDNF e BDNF promuovono la differenziazione neuronale e gliale. L’inibitore della segretasi a z consente una maggiore maturazione neurale. Il giorno 21, placcare le sfere (circa 1.000 sfere) su una membrana idrofila politetrafluoroetilene (PTFE) depositata su un inserto di piastra di coltura progettato per 6 pozzetti. Interrompere qualsiasi rotazione da questo passaggio. La presenza di rosette, osservate con un microscopio a campo luminoso, indicano l’avvio della differenziazione neurale. Le rosette neurali possono essere osservate 2-3 giorni dopo le sfere di placcatura sulla membrana PTFE. Aggiungere 1 mL di B27 medio integrato con fattori di crescita e inibitori (come seguito) per ogni ben sotto l’inserto della membrana, ogni 2-3 giorni (di solito il Lunedi, Mercoledì e Venerdì), per un successivo 3 settimane di differenziazione. Dai giorni 21-25, coltivare gli organoidi neurali umani nello stesso mezzo di maturazione neurale (Cf. passo 2.7.4). Dai giorni 25-28, completa solo il mezzo B27 con 1 – inibitore di segreto. Dai giorni 28-39, smetti di aggiungere l’inibitore della segretesi -z e continua la coltura degli organoidi neurali umani solo nel mezzo B27.NOTA: Dopo 3 settimane, gli organoidi neurali sono pronti all’uso per l’impianto GIC. Lungo la maturazione neurale, è stata osservata una diminuzione del marcatore nevralgico immaturo Nestin e un aumento dei marcatori neurali maturi3-tubulina e GFAP. 3. Isolamento e coltivazione di cellule che hanno invitato il glioblastoma (GIC) Isolare le GIC frammentando una biopsia GBM umana di alto grado. Trasferire il pezzo di tumore in un becher contenente 0.25% di prova in 0.1 mM EDTA (4:1) e mescolare lentamente a 37 s per 30-60 min (a seconda delle dimensioni del tumore). Piastra delle cellule dissociate in 75 cm2 flaconi di coltura tissutale placcate a 2.500-5.000 cellule per cm2 nel mezzo GIC: DMEM/F-12 medio (1:1) contenente 1% N2, 1% B27, e 1% G5 integratori (per favorire la sopravvivenza del GIC), integrati con bFGF e EGF (entrambi a 10 ng/Ml, per promuovere la stesità) e l’1% della penicillina/streptomicina. Una volta che il GIC è ben consolidato e in crescita, rimuovere i supplementi N2 e G5 dal supporto GIC. Un giorno prima di aggiungere le cellule sull’organoide, dissociare le GIC e contarle. Sciacquare la piastra microwell con 2 mL di mezzo GIC e centrifugare la piastra alla velocità massima per rimuovere le bolle (1000 x g). Posizionare le GIC a 1.000 cellule per ottenere una gliomasfera per microwell. Incubare pernottamento a 37 gradi centigradi (Figura1C). Questo passaggio è fondamentale e consente GIC ben calibrate (un esempio di GIF necrotiche e di dimensioni eccessive è illustrato nella Figura 2A,C). Per avviare l’invasione GBM, aggiungere una gliomasfera sopra il tessuto neurale con una grande punta del tubo di foro (Figura 1F). Riporre con cura la piastra 6 dell’incubatrice. 4. organoidi dopaminergici derivati da hESC per studi pd Giorno 0: amplifica gli hESC nella cultura 2D fino al 60% di confluenza (giorno 0), quindi sostituisci i supporti delle cellule staminali utilizzate per mantenere le caratteristiche di pluripotenza degli HESC con un mezzo privo di siero. Iniziare l’induzione neurale completando il mezzo di coltura con 0,5 M di inibitore di BMP e 10 -M inibitore TGF/Activin/Nodal (cocktail di inibizione a doppio SMAD), quindi aggiungere 10 inibitore ROCK m per 24 h per aumentare il tasso di sopravvivenza delle cellule durante il passaggio. Giorno 1: Preparare la piastra microwell con 2,5 mL per pozzo di mezzo senza siero integrato con 0,5 inibitori BMP, 10 inibitore TGF/Activin/Nodal e 10M inibitore rock. Per specificare le cellule verso il modello ventrale del tubo neurale, aggiungere 100 ng/mL Sonic Hedgehog (SHH), 100 ng/mL fattore di crescita fibroblasto 8 (FGF8) e 2 agonista levigato. Centrifugare la piastra (solo con cellule medie e senza cellule) a 1200 x g per 5 min per rimuovere le bolle d’aria dai micropozzi. Dopo 1 giorno di induzione neurale in 2D, rimuovere il mezzo e lavare rapidamente con PBS senza Ca2 o/MgCl2. Dissociare le colonie in sospensione a celle singole aggiungendo 7,5 mL di soluzione enzimatica ricombinante in un flacone T75 cm 2. Incubare per 2 min a 37 s poi completare con 7,5 mL di DMEM-F12. Raccogliere la sospensione cellulare e la centrifuga a 300 x g per 5 min. Rimuovere il supernatante e contare le cellule nello stesso mezzo utilizzato per preparare la piastra di microwell. Regolare il volume medio per ottenere una sospensione cellulare che consenta di formare neurosfere contenenti 1000 cellule per micropolo (ad esempio, la piastra di microwell utilizzata qui contiene 4.700 micropozzi per pozzo). Quindi, preparare 4,7 milioni di cellule in 2,5 mL di mezzo e aggiungerlo al precedente 2,5 mL di mezzo già collocato nella piastra. Al fine di distribuire correttamente le cellule in ogni micropolo, scuotere delicatamente la piastra e centrifugare la piastra microwell 300 x g per 5 min. Incubare la piastra a 37 gradi centigradi per 24 h per generare sfere. Giorno 2: Lavare delicatamente i micropozzi con il mezzo e raccogliere quindi trasferire le sfere in una piastra a sei pozzeti trattata con i tessuti. Sostituire medio con mezzo Neurobasal integrato con 1% B27, 1x NEAA, 2 mM L-glutamine, e 1% di penicillina / streptomicina. Inoltre, aggiungere fattori di regionalizzazione SHH, FGF8, agonista levigato, e doppia-SMAD inibizione piccole molecole. Posizionare le sfere a rotazione a 37 gradi centigradi (60 giri, agitatore orbitale) e cambiare metà medio appena integrato ogni 2-3 giorni. Giorno 3: Per migliorare l’induzione neurale e convertirsi in progenitori neurali con un’identità midbrain, integrare il mezzo con 3 inibitori GSK-3, che attiva la via Wnt / – catenina. Mantenere l’inibitore di GSK-3 nel mezzo fino al giorno 13. Dividi litibio in due nuove placche di 6 pozzetti trattati con i tessuti per ridurre sia la densità della sfera per pozzo ed evitare l’aggregazione della sfera.NOTA: al giorno 8, la maggior parte delle celle dovrebbe essere positiva per Nestin. Giorno 8: Avviare la maturazione neurale: sostituire i fattori di regionalizzazione SHH, FGF8, agonista levigato, e doppio-SMAD cocktail inibizione con 0,5 mM dibutyryl cAMP (per favorire la maturazione), 20 nM inibitore di istone deacetylase (per l’uscita del ciclo cellulare), 1 inibitori e fattori di crescita, 10 ng/mL GDNF, 10 ng/mL BDNF, 1 ng/mL che trasforma il fattore di crescita di trasformazione 3 (TGF) e 5 ng/mL FGF20 (entrambi favoriscono la sopravvivenza del progenitore DA). Cambiare il mezzo ogni 2-3 giorni. Giorno 21: Generare l’organoide neurale: semi circa 100 neurosfere in condizioni di interfaccia aria-liquido sulla membrana PTFE (6 mm di diametro). Trasferire la membrana in un inserto piastra di coltura (0,4 mm) e aggiungere 1,2 mL di mezzo di maturazione neurale utilizzato per la differenziazione della neurosfera, come descritto in precedenza. Interrompere qualsiasi rotazione da questo passaggio. Cambiare il mezzo ogni 2-3 giorni fino a ottenere il punto di tempo di differenziazione richiesto.NOTA: Per quanto riguarda la maturazione neurale, è stata osservata una diminuzione del marcatore nevralgico immaturo Nestin e l’aumento dei marcatori neurali maturi di 3 tubuline e GFAP. Sono state osservate espressioni TH e NURR1 elevate (Figura 3C) e confermano la maturità degli organidici neurali11. 5. Quantificazione dell’espressione genica TH e Nurr1 per la convalida della differenziazione dopaminergica Estrazione dell’RNA: il giorno di differenziazione indicato, lisse 40 neurosfere con 350 l di tampone RLT (fornito nel kit di estrazione dell’RNA) completate da 3,5 :L di 2-mercaptoetanolo. Estrarre l’RNA dalle neurosfere lismi utilizzando un kit di estrazione dell’RNA seguendo le istruzioni del produttore. Quantificare le concentrazioni totali di RNA. Eseguire la trascrizione inversa di 300 ng dell’estrazione totale dell’RNA utilizzando il kit di trascrizione inversa per la reazione quantitativa della catena di polimerasi in tempo reale (qPCR) e seguire le istruzioni del produttore . Eseguire l’analisi qPCR su sistemi di rilevamento PCR in tempo reale, sulla base del rilevamento asimmetrico dei coloranti di cianina. Normalizzare i dati con i geni delle pulidi: dehydrogenasi gliceraldeide-3-fosfato (GAPDH) e fattore di allungamento 1-alfa (EF1). Le sequenze di primer sono descritte nella Tabella 1. 6. Rilevamento di cromatografia liquida ad alta pressione (HPLC) Utilizzare cromatografia liquida ad alta pressione (HPLC) con rilevamento elettrochimico per rilevare la presenza di dopamina. La dopamina è stata estratta da organoidi neurali lisci in 100 mL di 0,1 N acido perclorico (HClO4) per 15 min a 4 gradi centigradi con un vortice vigoroso ogni 5 min. Dopo la centrifuga, raccogliere e conservare il supernatante a -20 gradi centigradi per il dosaggio della dopamina. Utilizzare una colonna C-18 (5 m, 4,6 mm x 150 mm) per separare gli analiti con HPLC in fase invertita in modalità isocratica a una velocità di flusso di 1 mL/minuto. La rilevazione della dopamina deve essere effettuata utilizzando un rilevatore coulometrico con la cella di condizionamento impostata ad un potenziale di 200 mV. 7. Registrazione dei dati grezzi con piattaforma MEA (microelectode array) Utilizzare un microscopio a dissezione per trasferire le neurosfere al centro di un dispositivo MEA poroso. Utilizzare un amplificatore e un sistema di acquisizione dati per registrazioni elettrofisiologiche. Misurare il rapporto segnale-rumore (SNR) come deviazione standard della tensione durante una registrazione di 5 min, utilizzando il segnale come tensione media picco-picco dei picchi registrati negli stessi 5 periodi min.