Menselijke neurale Organoïden voor het bestuderen van hersenkanker en neurodegeneratieve ziekten
Summary
Deze studie introduceert en beschrijft protocollen voor het afleiden van twee specifieke menselijke neurale organoïden als een relevant en nauwkeurig model voor het bestuderen van 1) menselijke multiform glioblastoom ontwikkeling binnen menselijke neurale organoïden uitsluitend bij de mens en 2) neuron Dopaminerge differentiatie die een driedimensionale organoïde genereert.
Abstract
Het ontbreken van relevante in vitro neurale modellen is een belangrijk obstakel voor medische vooruitgang voor neuro pathologieën. De oprichting van relevante cellulaire modellen is van cruciaal belang om de pathologische mechanismen van deze ziekten beter te begrijpen en nieuwe therapeutische doelen en strategieën te identificeren. Om relevant te zijn, moet een in vitro model de pathologische kenmerken van een menselijke ziekte reproduceren. Echter, in de context van neurodegeneratieve ziekte, een relevante in vitro model moet voorzien neurale cel vervanging als een waardevolle therapeutische kans.
Een dergelijk model zou niet alleen de screening van therapeutische moleculen mogelijk maken, maar kan ook worden gebruikt om de neurale protocol differentiatie te optimaliseren [bijvoorbeeld in de context van transplantatie bij de ziekte van Parkinson (PD)]. Deze studie beschrijft twee in vitro protocollen van 1) menselijke multiform glioblastoom ontwikkeling binnen een menselijke neurale organoïden (no) en 2) neuron Dopaminerge (da) differentiatie genereren van een driedimensionale (3D) organoid. Hiertoe werd een goed gestandaardiseerd protocol vastgesteld dat de productie van maat-gekalibreerde neuro sferen mogelijk maakt, afgeleid van de menselijke embryonale stamcel (hESC) differentiatie. Het eerste model kan worden gebruikt om moleculaire en cellulaire gebeurtenissen te onthullen die zich voordoen tijdens de ontwikkeling van multiform glioblastoom binnen de neurale organoïde, terwijl de da organoïde niet alleen een geschikte bron van da-neuronen voor celtherapie in de ziekte van Parkinson vertegenwoordigt, maar ook kan worden gebruikt voor het testen van geneesmiddelen.
Introduction
De World Health Organization (WHO) classificeert astrocytomen als lage graad (graad I tot II) of hoge graad (graad III en IV). Glioblastoma multiforme (GBM) is een astrocytoom grade IV, de meest dodelijke van primaire hersentumoren, die resistent is tegen alle huidige vormen van behandelingen1. Ondanks Standard-of-Care-therapie, waaronder Neurochirurgie, chemotherapie en radiotherapie, blijft GBM fataal en is de totale overlevings snelheid van 15 maanden niet drastisch veranderd in de afgelopen 15 jaar2. Om aanzienlijke vooruitgang te maken in het begrijpen van de pathogenese van GBM, is het gebruik van relevante modellen essentieel. Tot nu toe, de studie van GBM heeft vertrouwd op cellijnen, knaagdier organotypic plakjes, en xenotransplantatie van patiënt-afgeleide cellen in muizen of transgene muizen ontwikkelen spontane tumoren3,4. Hoewel deze modellen nuttig zijn voor het bestuderen van hersenmetastasen en tumor agressiviteit, ze worden beperkt door verschillen tussen soorten, en daaruit voortvloeiende conclusies kunnen onjuist worden vertaald naar menselijke weefsels. Bovendien, bestaande modellen met menselijke cellen worden ook beperkt door de afwezigheid van gastheer weefsel/tumor interacties3,4. Experimentele modellen zijn van cruciaal belang voor de vertaling van basiswetenschap naar therapeutische doelen. Daarom, het beschrijven van een protocol voor de productie in vitro menselijke neurale organoïden co-gekweekte met GBM-initiëren cellen (GICs) kan een relevant systeem dat de morfologische en functionele kenmerken van GBM ontwikkeling nabootst bieden. Dit systeem reproduceert sommige in vivo kenmerken van GBM developmentzoals diffuse migratie van binnenvallende cellen en necrose gebieden, en het markeert genexpressie relevant voor tumor biologie. Zoals eerder onthuld, worden sommige kritische microrna’s geïnduceerd tijdens de GIC ontwikkeling binnen 3D zenuwweefsel5,6.
PD is een belangrijke neurodegeneratieve aandoening en geassocieerd met de degeneratie van meerdere neuronale subtypen7. Zelfs als een progressief begin van symptomen (bijv. bradykinesie, asymmetrische rust tremor, stijfheid en houdingsinstabiliteit) de ziekte karakteriseert, is de exacte etiologie niet duidelijk vastgesteld. Inderdaad, veel studies hebben aangetoond dat belangrijke risicofactoren kunnen voortvloeien uit een combinatie van genetische en omgevingsfactoren. Parkinsonische symptomen worden geassocieerd met de bilaterale degeneratie van Dopaminerge neuronen in de substancia nigra (SN), wat leidt tot het verdwijnen van Dopaminerge (da) axonen die projecteren naar het striatum8,9. Daarom is de reductie van striatale dopamine niveaus gecorreleerd met progressie van motorische disfunctie bij PD-patiënten. Dopaminerge neuronen bevatten Tyrosine hydroxylase (TH), een belangrijk enzym in de synthese van catecholaminerge neurotransmitters dat het aminozuur L-tyrosine converteert naar L-3, 4-dihydroxyphenylalanine (levodopa, een voorloper van dopamine) dopamine10. Vroegtijdig verlies van de activiteit gevolgd door een afname van de eiwit expressie is een kenmerk van PD.
Deze studie beschrijft twee protocollen met behulp van menselijke neurale organoïden, met een specifiek gericht op een midbrain-achtige fenotype verrijkt met TH-positieve cellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Een van de meest kritische aspecten van dit protocol omvat het onderhoud van hESC pluripotentie tijdens celculturing en nauwste monitoring van de bollen en neurale organoïde morfologie. hESCs zijn zeer gevoelig en elke manipulatie kan leiden tot vroegtijdige ongecontroleerde differentiatie en celdood. Om de experimentele reproduceerbaarheid te verhogen en het optreden van abnormale karyotype-gebeurtenissen te voorkomen, wordt het aangeraden om meerdere batches van hescs bij de laagste passage te invriezen na validatie van hun chromosoom stabiliteit. Bovendien wordt aanbevolen om voor elk experiment een nieuwe injectieflacon te ontdooien en het gedrag van de cellen elke dag te controleren. Als de bollen minder refractieve met abnormale hogere grootte, zullen ze waarschijnlijk beginnen te aggregeren en sterven.
Een verbetering op dit systeem is ofwel perfusie of het implementeren van een gevasculariseerde systeem (door toevoeging van endotheliale cellen of binnen een 3D fluidic microchip)12,13. Echter, het beheersen van de dikte van de neurale organoïde (≤ 300 μm) maakt efficiënte passieve perfusie van zuurstof en voedingsstoffen mogelijk en voorkomt necrose. Een andere verbetering is de introductie van immuuncellen (Microglia). Met deze beperkingen in het achterhoofd, neurale organoïden plus een GIC systeem kan een relevant instrument om verschillende redenen. Ten eerste, dit systeem maakt het mogelijk drug screening om te controleren hoe een therapeutische verbinding kan invloed hebben op een organoïde of tumor cel. Tweede, cel-naar-cel interacties kunnen worden bestudeerd, en micro-milieu determinanten onderliggende individuele en collectieve invasies kunnen worden gevisualiseerd en verkend5,6,13.
In het kader van de ziekte van Parkinson kan een neurale organoïde verrijkt in DA-neuronen een relevant en nauwkeurig 3D-model vormen om de ontwikkeling van de ziekte te bestuderen. In eerdere studies, Parkinson door de patiënt afgeleide geïnduceerde pluripotente stamcellen gedifferentieerd naar DA neuronen zijn gebruikt voor het bestuderen van de getroffen neuronale subtypes. Van noot, sommige ziektegerelateerde fenotypes zoals de accumulatie van α-synuclein en gevoeligheid voor oxidatieve stress zijn waargenomen14,15. Bovendien, de neurale organoïde kan worden gebruikt als een instrument om therapeutische moleculen te schermen. Echter, specifieke en relevante uitlezingen moeten worden ingesteld om te evalueren van de overleving en functionaliteit van DA neuron, zoals dopamine productie en elektrofysiologische activiteit. In totaal, dit protocol biedt twee gestandaardiseerde en nauwkeurige stamcel gebaseerde benaderingen voor het genereren van neurale organoïden.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedanken la Ligue Genevoise contre le Cancer (Genève, Zwitserland), ISREC Foundation (Lausanne, Zwitserland), en de Clayton Foundation for Research (Houston, TX, USA) voor financiële ondersteuning. Bovendien danken de auteurs HES-HO en het Wyss Center voor financiële steun. We bedanken het lab van Krause voor nuttige discussies en ondersteuning en Dr. Halah Kutaish voor proeflezen.
Materials
| 6-well plate (6-well plate) | Falcon / Corning | 07-201-588 | |
| ABI Prism 7900 HT detection system (Real-Time PCR detection systems) | Applied Biosystems | Discontinued | |
| Aggrewell 400 (Microwell culture plates ) | StemCell Technologies | 34421 | |
| Amplifier (W2100-HS32) (Amplifier) | Multi Channel Systems | ||
| Anti-EGFR (phospho Y1101) antibody | Abcam | ab76195 | 1/100 dilution |
| Anti-GFAP Antibody | Dako | Z334 | 1/1000 dilution |
| Anti-Nestin, Human Antibody | Millipore | ABD69 | 1/400 dilution |
| Anti-Synapsin I Antibody | Chemicon | AB1543P | 1/500 dilution |
| B27 supplements (B27) | Life Technologies / Invitrogen | 1238 | For both protocol, stock solution 100x, final solution 1x |
| Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) | Cell Guidance | GFH1-2 | For both protocol, stock solution 100 µg/mL in pure H2O, final solution 20 ng/mL |
| CHIR-99021 (GSK-3β inhibitor ) | Axon Medchem | ct99021 | For Dopaminergic protocol, stock solution 7.5 mM in DMSO, final solution 3 µM |
| Compound E a γ–secretase inhibitor (γ–secretase inhibitor) | Calbiochem | CAS 209986-17-4 | For both protocol (gamma-secretase inhibitor XXI), stock solution 5 mM in DMSO, final solution 1 µM |
| Coulochem III (Coulometric detector parameters) | Thermo scientific | ||
| Dibutyryl cyclic-AMP (Dibutyryl cAMP) | Sigma | D0627 | For Dopaminergic protocol, stock solution 0.5 M in DMSO, final solution 0.5 mM |
| Dimethyl Sulfoxide Pure (DMSO) | Sigma-Aldrich | C6164 | Compounds solvent, ready to use |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 12491-015 | For cell culture, ready to use |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium Mixture F-12 (DMEM-F12) | Gibco | 11320033 | For cell culture, ready to use |
| EDTA 0.1 mM (EDTA) | Life Technologies | AM9912 | For cell culture, ready to use |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | Gibco | PHG0313 | For GIC culture, stock solution 100 µg/mL in pure H2O, final solution 10 ng/mL |
| Fibroblast Growth Factor 20 (FGF20) | Peprotech | 100-41 | For Dopaminergic protocol, stock solution 100 µg/mL in pure H2O, final solution 5 ng/mL |
| fibroblast growth factor 8 (FGF8) | Peprotech | GFH176-5 | For Dopaminergic protocol, stock solution 100 µg/mL in pure H2O, final solution 100 ng/mL |
| Fibroblast growth factor-basic (bFGF) | Gibco | PHG0024 | For GIC culture, stock solution 100 µg/mL in pure H2O, final solution 10 ng/mL |
| G5 supplements (G5) | Invitrogen | 17503012 | For GIC culture, stock solution 100x, final solution 1x |
| Glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF) | Cell Guidance | GFH2-2 | For both protocol, stock solution 100 µg/mL in pure H2O, final solution 20 ng/mL |
| Hydrophilic polytetrafluoroethylene membrane (PTFE membrane) | BioCell-Interface | Discontinued | |
| LDN-193189 (BMP inhibitor) | Axon Medchem /Stemgen | 04-0072-02 /1509 | Dual/Smad, stock solution 5 mM in DMSO, final solution 0.5 µM |
| L-glutamine (L-glutamine) | Gibco | 25030081 | L-Glutamine (200 mM), stock solution 200 mM, final solution 2 mM |
| Matrigel (extracellular matrix) | BD Biosciences | 354277 | hESC-qualified Matrix, stock solution 18-22 mg/mL, final solution 180-220 µg/mL |
| Millicell-CM Culture plate insert (0.4 µm) (Culture plate insert) | Millipore | PICM03050 | |
| Monoclonal Anti-β-Tubulin III antibody | Sigma | T8660 | 1/1000 dilution |
| MS Orbital Shaker, MS-NOR-30 (Orbital shaker) | Major Science | MS-NRC-30 | |
| N2 supplements (N2) | Invitrogen | 17502-048 | For GIC culture, stock solution 100x, final solution 1x |
| Nanodrop (Nanodrop) | Thermo Fisher Scientific | Discontinued | |
| Neurobasal (Neurobasal) | Life Technologies / Gibco | 21103049 | Maintenance and maturation embryonic neuronal cell populations , ready to use |
| Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Gibco | 11140 | Non-essential Amino Acids 100X, stock solution 100x, final solution 1x |
| Nurr1 Antibody (M-196) | Santa Cruz | Sc-5568 | 1/100 dilution |
| Nutristem (hESC medium ) | Biological Industries | 05-100-1A | Stem cell media, ready to use |
| Penicilin / Streptomycin (Penicilin / Streptomycin ) | Life Technologies / Gibco | 15140122 | For cell culture, stock solution 5 mg/mL, final solution 50 µg/mL |
| Perchloric acid 0.1N (HCLO4) | Merck | 100519 | For HPLC, ready to use |
| Phosphate Buffered Saline without Ca2+/Mg2+ (PBS without Ca2+/Mg2+ ) | Life Technologies | 14190250 | For cell culture, ready to use |
| PrimeScript RT-PCR Kit (Reverse transcription kit) | Takara | RR014A | |
| Purmorphamin (smoothened agonist) | Calbiochem | SML0868 | For Dopaminergic protocol, stock solution 10 mM in DMSO, final solution 2 µM |
| Rho-associated Kinase Y-27632 (ROCK) | Abcam Biochemicals | ab120129-1 | Rock Inhibitor, stock solution 50 mM in DMSO, final solution 10 µM |
| RNeasy mini kit (RNA extraction kit ) | Qiagen | 74104 | |
| SB-431542 (TGFβ/Activin/Nodal inhibitor ) | Ascent | Asc- 163 | Dual-Smad, stock solution 50 mM in DMSO, final solution 10 µM |
| Sonic Hedgehog (SHH) | Cell Guidance | GFH168-5 | For Dopaminergic protocol, stock solution 100 µg/mL in pure H2O, final solution 100 ng/mL |
| StemPro Accutase (hESC enzymatic solution) | Gibco | A11105-01 | hESC enzymatic solution, ready to use |
| Symmetry C-18,5 mm (4.6 150mm2) (Reversed-phase column) | Waters Corporation | ||
| T150 flask (T150 flask) | Falcon | 08-772-1F | |
| TH Antibody (F-11) | Santa Cruz | Sc-25269 | 1/200 dilution |
| Transforming Growth Factors beta 3 (TGFβ3) | Cell Guidance | GFH109-2 | For Dopaminergic protocol, stock solution 100 µg/mL in pure ethanol , final solution 1 ng/mL |
| Trichostatine A (inhibitor of histone deacetylase ) | Sigma | T8552 | For Dopaminergic protocol, stock solution 100 µM in DMSO, final solution 20 nM |
| TrypLE (recombinant enzymatic solution) | Invitrogen | 12604021 | recombinant enzymatic solution, ready to use |
| Trypsin 0.25% (enzymatic solution) | Life Technologies | 15050065 | enzymatic solution, ready to use |
| W2100, Multi Channel Systems (Data acquisition system ) | WAT045905 | ||
| X-vivo (serum free medium) | Lonza | BE04-743Q | serum free medium, ready to use |
References
- Louis, D. N., et al. The 2016 World Health Organization Classification of Tumors of the Central Nervous System: a summary. Acta Neuropathologica. 131 (6), 803-820 (2016).
- Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. New England Journal of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).
- Daphu, I., et al. In vivo animal models for studying brain metastasis: value and limitations. Clinical and Experimental Metastasis. 30 (5), 695-710 (2013).
- Huszthy, P. C., et al. In vivo models of primary brain tumors: pitfalls and perspectives. Neuro Oncology. 14 (8), 979-993 (2012).
- Nayernia, Z., et al. The relationship between brain tumor cell invasion of engineered neural tissues and in vivo features of glioblastoma. Biomaterials. 34 (33), 8279-8290 (2013).
- Cosset, E., et al. Human tissue engineering allows the identification of active miRNA regulators of glioblastoma aggressiveness. Biomaterials. 107, 74-87 (2016).
- Pringsheim, T., Jette, N., Frolkis, A., Steeves, T. D. The prevalence of Parkinson’s’s disease: a systematic review and meta-analysis. Movement Disorders. 29 (13), 1583-1590 (2014).
- Rajput, A. H., et al. Globus pallidus dopamine and Parkinson’s motor subtypes: clinical and brain biochemical correlation. Neurology. 70 (16 Pt 2), 1403-1410 (2008).
- Jellinger, K. A. Pathology of Parkinson’s’s disease. Changes other than the nigrostriatal pathway. Molecular and Chemical Neuropathology. 14 (3), 153-197 (1991).
- Bernheimer, H., Birkmayer, W., Hornykiewicz, O., Jellinger, K., Seitelberger, F. Brain dopamine and the syndromes of Parkinson’s and Huntington. Clinical, morphological and neurochemical correlations. Journal of Neurological Science. 20 (4), 415-455 (1973).
- Tieng, V., et al. Engineering of midbrain organoids containing long-lived dopaminergic neurons. Stem Cells and Development. 23 (13), 1535-1547 (2014).
- Chen, C. S. 3D Biomimetic Cultures: The Next Platform for Cell Biology. Trends in Cell Biology. 26 (11), 798-800 (2016).
- Friedl, P., Sahai, E., Weiss, S., Yamada, K. M. New dimensions in cell migration. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (11), 743-747 (2012).
- Byers, B., et al. SNCA triplication Parkinson’s’s patient’s iPSC-derived DA neurons accumulate alpha-synuclein and are susceptible to oxidative stress. PLoS ONE. 6 (11), e26159 (2011).
- Flierl, A., et al. Higher vulnerability and stress sensitivity of neuronal precursor cells carrying an alpha-synuclein gene triplication. PLoS ONE. 9 (11), e112413 (2014).
