Organoides neuronales humanos para el estudio del cáncer cerebral y las enfermedades neurodegenerativas

Este protocolo sigue las directrices del comité de ética de la investigación humana de la Universidad de Ginebra. 1. Mantenimiento y cultivo de células madre embrionarias humanas indiferenciadas (HESC) Realizar el mantenimiento y la expansión de los hSECs en condiciones libres de alimentación mediante el recubrimiento previo de platos con una matriz extracelular específica. Descongelar 300 ml de matriz extracelular a 4 oC (concentración de rango típico 18-22 mg/ml, mantener en hielo) y mezclar suavemente con 15 ml de medio DMEM frío para evitar una gelación prematura de la matriz extracelular. Añadir 7,5 ml del matric extracelular a ambos matraces T150. Incubar los platos recubiertos con matriz extracelular a 37oC durante al menos 1 h (máximo durante la noche). Retire los HESC medios y de semillas a una densidad de 6,5 x 104 celdas/cm2. Mantener H1 (línea celular de HESC) en el medio de hESC y 1% penicilina/estreptomicina. Pasar las células con procedimiento enzimático: añadir 7,5 ml de solución enzimática a un matraz T75 cm2 durante un período de 1-2 min a 37 oC. Una vez que las celdas estén completamente separadas, agregue 7,5 ml de DMEM-F12 y luego centrífuga durante 5 min a 300 x g. Para permitir una mejor supervivencia, vuelva a placar las células a la densidad deseada en platos recubiertos con matriz extracelular, en el mismo medio que contiene inhibidor de la proteína quinasa asociada a Rho (ROCK) (10 m) durante 24 horas. 2. organoides neuronales derivados del hESC para estudios de GBM 24 h antes de iniciar el cultivo 3D, sustituya el medio hESC por un medio libre de suero complementado con un inhibidor de LANCA de 10 m (ambos componentes son necesarios para apoyar la supervivencia celular y la formación espontánea de la neurosfera durante la fase de agregación en un micropozo placa). Las células deben estar al 60% de confluencia. Al día siguiente (día 0), separe las colonias de hESC como células individuales: retire el medio, luego enjuague con PBS sin Ca2+/ Mg2+,agregue 5 ml de solución de disolución enzimática e incubar a 37 oC durante 1-2 min. Recoger las células en medio libre de suero con 10 m de inhibidor de ROCK y centrifugar las células a 300 x g durante 5 min. Retire el sobrenadante y cuente las células en 10 ml de medio libre de suero complementado con 10 oM de inhibidor de ROCK. En paralelo, enjuague la placa de micropocillos con 2 ml de medio libre de suero por pozo y centrifugar la placa a 1200 x g durante 5 min para eliminar todas las burbujas, lo que puede prevenir la formación de la neuroesfera. Preparar 28,2 x 106 de células en 12,5 ml de medio libre de suero complementado con inhibidor de ROCK de 10 m. Dispensar 1000 células/micropozo. Centrifugar las células a 300 x g durante 5 min y colocar la placa en la incubadora a 37oC durante la noche (máximo 36 h). Por ejemplo: para obtener 30 organoides neuronales humanos, utilice un matraz T150 al 70%-80% de la confluencia (alrededor de 30 millones de células). Al día siguiente (día 1), recoger las esferas (con un P1000) y colocarlos en un plato de 6 pozos. En cada poca, añadir 2 mL de medio B27 y DMEM-F12 GlutaMAX y medio neurobasal (mezcla a 1:1), complementado con 1% de suplementos B27 y 1% de aminoácidos no esenciales (NEAA). Para promover la inducción neuronal rápida, complemente el medio con un cóctel de inhibición dual-SMAD, compuesto por 10 M de TGF/Activin/Inhibidor Nodal e inhibidor de la proteína morfogénica ósea (BMP) de 0,5 m. A partir de este paso adelante, las esferas se cultivan en rotación (60 rpm, agitador orbital). La rotación es crítica para evitar que las esferas se peguen juntas o a la placa. Cambiar el medio cada 2-3 días: doblar la placa y dejar que las esferas caigan durante 5 min, quitar la mitad del medio (2 ml), y añadir 2 ml de medio B27 fresco complementado con factores de crecimiento e inhibidores. No centrifugar las esferas. Realizar la inducción neuronal de acuerdo con el siguiente curso de tiempo: A partir de los días 1-4, cultivar las esferas en el medio B27 complementado con dual-SMAD. El cóctel de inhibición de doble SMAD (10 M TGF/Activin/Inhibidor Nodal y inhibidor de LA BMP de 0,5 m) promueve la inducción neuronal. A partir de los días 4-11, promover la proliferación de rosetas neurales derivadas de hESC (en las esferas), añadiendo 10 ng/ml de factor de crecimiento epidérmico (EGF) y factor fibroblasto básico de 10 ng/mL (bFGF) al medio B27 complementado con cóctel de doble SMAD.NOTA: El día 11, la mayoría de las células deben ser positivas para la anidación. A partir de los días 11-13, el cultivo de las esferas en medio B27 complementado con inhibidor de BMP de 0,5 M. A partir de los días 13-21, cultivo de las esferas en el medio B27 complementado con factor neurotrófico derivado del glial de 10 ng/ml (GDNF), factor neurotrófico derivado del cerebro de 10 ng/ml (BDNF) y 1 M de inhibidor de la secretasa. GDNF y BDNF promueven la diferenciación neuronal y glial. El inhibidor de la secretasa permite una mayor maduración neuronal. En el día 21, placa las esferas (alrededor de 1.000 esferas) en una membrana de politetrafluoroetileno hidrófilo (PTFE) (6 mm de diámetro, 0,4 m) depositadas en un inserto de placa de cultivo diseñado para 6 placas de pozo. Detenga cualquier rotación de este paso. La presencia de rosetas, observadas con un microscopio de campo brillante, indican el inicio de la diferenciación neuronal. Las rosetas neurales se pueden observar 2-3 días después de las esferas de chapado en la membrana de PTFE. Añadir 1 ml de medio B27 complementado con factores de crecimiento e inhibidores (según se indica) a cada pocal debajo del inserto de membrana, cada 2-3 días (generalmente los lunes, miércoles y viernes), para unas siguientes 3 semanas de diferenciación. A partir de los días 21-25, cultivar los organoides neuronales humanos en el mismo medio de maduración neural (cf. paso 2.7.4). A partir de los días 25-28, solo complemente el medio B27 con un inhibidor de 1 m de secretasa. A partir de los días 28-39, deje de agregar el inhibidor de la secretasa y continúe el cultivo organoide neural humano solo en el medio B27.NOTA: Después de 3 semanas, los organoides neurales están listos para su uso para la implantación de GIC. A lo largo de la maduración neuronal, se observó una disminución del marcador inmaduro neural Nestin y el aumento de los marcadores neuronales maduros 3-tubulina y GFAP. 3. Aislamiento y cultivo de células que inician el glioblastoma (CIG) Aísle los GIF fragmentando una biopsia de GBM humana de alto grado. Transfiera el pedazo de tumor en un vaso de precipitados que contenga 0,25% de trippsina en 0,1 mM de EDTA (4:1) y revuelva lentamente a 37 oC durante 30-60 min (dependiendo del tamaño del tumor). Placa de las células disociadas en matraces de cultivo tisular de 75 cm2 chapados en 2.500-5.000 células por cm2 en medio GIC: medio DMEM/F-12 (1:1) que contiene 1% N2, 1% B27 y 1% suplementos de G5 (para favorecer la supervivencia gic), complementados con bFGF y EGF (ambos a 10% N2, 1% B27 y 1% suplementos de G5 (para favorecer la supervivencia gico), complementados con bFGF y EGF (ambos a 10% N2, 1% B27 y 1% suplementos de G5 (para favorecer la supervivencia de GIC), complementados con bFGF y EGF (ambos a 10% N2, 1% B27 y 1% suplementos De G5 (para favorecer la supervivencia de GIC), complementados con bFGF y EGF (ambos a 10% N2, 1% B27 y 1% suplementos de G5 (para favorecer la supervivencia de GIC), complementados con bFGF y EGF (ambos a 10% N2, 1% B27 ng/Ml, para promover la tallo) y 1% de penicilina/estreptomicina. Una vez que el GIC esté bien establecido y creciendo, retire los suplementos N2 y G5 del medio GIC. Un día antes de añadir las células al organoide, disociar los GIC y contarlos. Enjuague la placa de micropocillos con 2 ml de medio GIC y centrifugar la placa a la velocidad máxima para eliminar burbujas (1000 x g). Coloque los CIC en 1.000 células para obtener una gliomasfera por micropozo. Incubar durante la noche a 37 oC (Figura1C). Este paso es clave y permite LOS GIF bien calibrados (un ejemplo de LOS GIS necróticos y de gran tamaño se muestra en la Figura 2A,C). Para iniciar la invasión GBM, agregue una gliomasfera encima del tejido neural con una punta de pipeta de gran diámetro (Figura1F). Coloque cuidadosamente la placa de 6 pozos de nuevo en la incubadora. 4. Organoides dopaminérgicos derivados del hESC para estudios de DP Día 0: Amplificar los hESC en el cultivo 2D hasta un 60% de confluencia (día 0), luego reemplace los medios de células madre utilizados para mantener las características de pluripotencia de los HEC con un medio libre de suero. Inicie la inducción neuronal complementando el medio de cultivo con un inhibidor de BMP de 0,5 m y un inhibidor de 10 M De TGF/Activin/Nodal (cóctel de inhibición dual-SMAD), luego agregue un inhibidor de ROCK de 10 m durante 24 horas para aumentar la tasa de supervivencia de las células durante el paso. Día 1: Preparar la placa de micropocillos con 2,5 ml por pozo de medio libre de suero complementado con inhibidor de BMP de 0,5 m, 10 M de TGF/Activin/Inhibidor nodal y 10 oM de inhibidor de ROCK. Para especificar las células hacia el patrón ventral del tubo neural, agregue 100 ng/ml de sonic erizo (SHH), 100 ng/ml de factor de crecimiento de fibroblastos 8 (FGF8) y agonista suavizado de 2 m. Centrifugar la placa (sólo con células medianas y sin células) a 1200 x g durante 5 min para eliminar las burbujas de aire de los micropocillos. Después de 1 día de inducción neuronal en 2D, retire el medio y lave rápidamente con PBS sin Ca2+/MgCl2+. Disociar las colonias en suspensión de células individuales añadiendo 7,5 ml de solución enzimática recombinante en un matraz T75 cm 2. Incubar durante 2 min a 37oC y luego completar con 7,5 mL de DMEM-F12. Recoger la suspensión celular y centrífuga a 300 x g durante 5 min. Retire el sobrenadante y cuente las células en el mismo medio utilizado para preparar la placa de micropocillos. Ajustar el volumen medio para obtener una suspensión celular que permite formar neuroesferas que contienen 1000 células por micropocillo (por ejemplo, la placa de micropocillos utilizada aquí contiene 4.700 micropocillos por pocillo). Por lo tanto, preparar 4,7 millones de células en 2,5 ml de medio y añadirlo a los 2,5 ml anteriores de medio ya colocados en la placa. Con el fin de distribuir correctamente las células en cada micropocillo, agitar suavemente la placa, y centrifugar la placa de micropocillos 300 x g durante 5 minutos. Incubar la placa a 37 oC durante 24 h para generar esferas. Día 2: Enjuague suavemente los micropocillos con el medio y recoja las esferas en una placa de seis pocillos tratada con tejido. Reemplace el medio por medio neurobasal complementado con 1% B27, 1x NEAA, 2 mM de L-glutamina y 1% de penicilina/estreptomicina. Además, agregue los factores de regionalización SHH, FGF8, agonista suavizado y moléculas pequeñas de inhibición dual-SMAD. Colocar las esferas en rotación a 37 oC (60 rpm, agitador orbital) y cambiar medio medio recién complementado cada 2-3 días. Día 3: Para mejorar la inducción neuronal y convertiren en progenitores neuronales con una identidad de cerebro medio, complemente el medio con el inhibidor GSK-3 de 3 m, que activa la vía Wnt/-catenina. Mantener el inhibidor gSK-3 en el medio hasta el día 13. Dividir en dos nuevas placas de 6 pozos tratadas con tejido para reducir la densidad de la esfera por pozo y evitar la agregación de esferas.NOTA: En el Día 8, la mayoría de las células deben ser positivas para la Nestin. Día 8: Iniciar la maduración neuronal: reemplazar los factores de regionalización SHH, FGF8, agonista suavizado y cóctel de inhibición dual-SMAD con 0,5 mM de campo de dibutilo (para favorecer la maduración), inhibidor de 20 nM de la histona deacetilasa (para la salida del ciclo celular), 1 m de secretasa inhibidores y factores de crecimiento, 10 ng/mL GDNF, 10 ng/mL BDNF, 1 ng/mL transformando el factor de crecimiento n.o 3 (TGF-3) y 5 ng/mL FGF20 (ambos favorecen la supervivencia del progenitor DA). Cambie el medio cada 2-3 días. Día 21: Generar el organoide neural: semilla alrededor de 100 neuroesferas bajo condiciones de interfaz aire-líquido en membrana de PTFE (6 mm de diámetro). Transfiera la membrana a un inserto de placa de cultivo (0,4 mm) y añada 1,2 ml de medio de maduración neuronal utilizado para la diferenciación de la neuroesfera como se describió anteriormente. Detenga cualquier rotación de este paso. Cambie el medio cada 2-3 días hasta que se alcance el punto de tiempo de diferenciación requerido.NOTA: En cuanto a la maduración neuronal, se observó una disminución del marcador inmaduro neural Nestin y el aumento de los marcadores neuronales maduros 3-tubulina y GFAP. Se observaron expresiones HIGH TH y NURR1 (Figura3C)y confirmaron la madurez organoide neural11. 5. Cuantificación de la expresión génica TH y Nurr1 para la validación de la diferenciación dopaminérgica Extracción de ARN: En el día indicado de diferenciación, leja 40 neurosferas con 350 l de tampón RLT (proporcionado en kit de extracción de ARN) complementado con 3,5 l de 2-mercaptoetanol. Extraiga el ARN de las neuroesferas lysed usando un kit de extracción de ARN siguiendo las instrucciones del fabricante. Cuantificar las concentraciones totales de ARN. Realice la transcripción inversa de 300 ng de la extracción total de ARN utilizando un kit de transcripción inversa para la reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa en tiempo real (qPCR) y siga las instrucciones del fabricante. Realice análisis qPCR en sistemas de detección de PCR en tiempo real, basados en la detección asimétrica de tinte de cianina. Normalizar los datos con genes de limpieza: gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) y factor de alargamiento 1-alfa (EF1). Las secuencias de imprimaciones se describen en la Tabla 1. 6. Detección de cromatografía líquida de alta presión (HPLC) Utilice cromatografía líquida de alta presión (HPLC) con detección electroquímica para detectar la presencia de dopamina. La dopamina se extrajo al lisiar organoides neurales en 100 ml de 0.1 N ácido perclórico (HClO4) durante 15 minutos a 4 oC con un vórtice vigoroso cada 5 min. Después de la centrifugación, recoger y almacenar el sobrenadante a -20 oC para la dosis de dopamina. Utilice una columna C-18 (5 m, 4,6 mm x 150 mm) para separar los analitos por HPLC de fase invertida en modo isocrático a un caudal de 1 ml/minuto. La detección de dopamina debe llevarse a cabo utilizando un detector coulométrico con la célula acondicionador establecida en un potencial de +200 mV. 7. Grabación de datos sin procesar con plataforma de matriz microelectode (MEA) Utilice un microscopio de disección para transferir las neuroesferas al centro de un dispositivo MEA poroso. Utilice un amplificador y un sistema de adquisición de datos para grabaciones electrofisiológicas. Mida la relación señal-ruido (SNR) como la desviación estándar de la tensión durante una grabación de 5 minutos, utilizando la señal como la tensión promedio de pico a pico de los picos registrados en los mismos 5 períodos min.