ארגונית עצבית אנושית לחקר סרטן המוח ומחלות ניווניות

פרוטוקול זה מלווה בהנחיות ועדת האתיקה של המחקר האנושי באוניברסיטת ז’נבה. 1. תחזוקה ותרבות של מובחן בתאי גזע עובריים האדם (hESCs) בצע תחזוקה והרחבה של hSECs בתנאים ללא מאכיל על ידי מנות ציפוי מראש עם מטריצה מסוימת. הפשרת 300 μL של מטריצה החילוץ ב 4 ° צ’ (ריכוז טווח אופייני 18-22 mg/mL, לשמור על קרח) ולערבב בעדינות עם 15 מ ל של מדיום קר DMEM כדי למנוע הגגנציה מוקדמת של מטריצה החילוץ. הוסף 7.5 מ ל של מT150 מתוך החילוץ לשני מבחנות שניהם. מכסימום הצלחות מצופות במטריצה ב37 מעלות צלזיוס לפחות 1 h (מקסימום לילה). הסר את המדיום ואת הזרע hESCs לצפיפות של 6.5 x 104 תא/cm2. שמור על H1 (קו התאים של hESC) ב hESC בינונית ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין. להעביר את התאים עם הליך אנזימטי: להוסיף 7.5 mL של פתרון אנזימטי T75 ס מ2 בקבוקון על פני תקופה של 1-2 דקות ב 37 ° c. לאחר תאים מנותקים לחלוטין, להוסיף 7.5 mL של Dמאמ-F12 ולאחר מכן צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 300 x g. כדי לאפשר הישרדות טובה יותר, לוחית מחדש התאים בצפיפות הרצויה על מנות מצופה מטריקס מגולוון, באותו בינוני המכיל את החומר המקושר Rho-חלבון קינאז (10 μM) עבור 24 שעות. 2. המיסק-מאורגנואידים ללימודי GBM 24 שעות לפני תחילת התרבות 3D, להחליף את המדיום hESC עם מדיום ללא סרום שיושלם עם 10 μM סלע מעכבי (שני הרכיבים נחוצים כדי לתמוך הישרדות התאים והיווצרות נוירוספירה ספונטנית בשלב הצבירה במיקרוגל צלחת). התאים אמורים להיות. ב60% בשטף למחרת (יום 0), ניתוק מושבות hESC כתאים בודדים: להסיר את המדיום, ולאחר מכן לשטוף עם PBS ללא Ca2 +/Mg2 +, להוסיף 5 מ ל של פתרון הפירוק אנזימטי, ו-דגירה ב 37 ° c עבור 1-2 דקות. לאסוף את התאים בינונית ללא סרום עם 10 μM של סלע מעכב ו צנטריפוגה את התאים ב 300 x g עבור 5 דקות. להסיר את supernatant ולספור את התאים ב 10 מ ל של מדיום ללא סרום שיושלם עם 10 ΜM של סלע מעכב. במקביל, לשטוף את צלחת המיקרוגל עם 2 מ ל של מדיום ללא סרום לבאר ו צנטריפוגה את הצלחת ב 1200 x g עבור 5 דקות כדי להסיר את כל הבועות, אשר יכול למנוע היווצרות נוירוספירה. להכין 28.2 x 106 של תאים ב 12.5 מ ל של סרום-מדיום חינם שיושלם עם 10 ΜM סלע מעכב. לוותר 1000 תאים/למיקרוגל. צנטריפוגה את התאים ב 300 x g עבור 5 דקות ומניחים את הצלחת בחממה ב 37 ° c לילה (מקסימום 36 h). לדוגמה: כדי להשיג 30 מעצבי גוף אנושיים, השתמש בבקבוקון T150 אחד ב-70%-80% ממפגש הזרימה (כ-30,000,000 תאים). למחרת (יום 1), לאסוף את הספירות (עם P1000) ולמקם אותם בצלחת 6 היטב. בכל טוב, להוסיף 2 מ ל של B27 בינונית ו DMEM-F12 GlutaMAX ו Neurobasal סיס בינונית (לערבב ב 1:1), שיושלם עם 1% תוספי תזונה ו 1% חומצות אמינו לא חיוניות (NEAA). כדי לקדם אינדוקציה עצבית מהירה, הוסף את המדיום עם קוקטייל כפול SMAD עיכוב, מורכב 10 μM TGFβ/מעכב פעילות/Nodal מעכבי ו-0.5 μM עצם מורפולגניים חלבון (BMP) מעכב. משלב זה קדימה, התחומים הם מתורבתים בסיבוב (60 rpm, שייקר מסלולית). הסיבוב הוא קריטי כדי למנוע את הכדורים לדבוק יחד או לצלחת. לשנות את המדיום כל 2-3 ימים: לכופף את הצלחת ולתת את הספירות ליפול 5 דקות, להסיר מחצית המדיום (2 מ ל), ולהוסיף 2 מ ל B27 בינוני טרי בתוספת גורמי צמיחה מעכבי. . אל צנטריפוגה את הספירות ביצוע האינדוקציה העצבית לפי קורס הזמן הבא: החל מימים 1-4, התרבות הספירות במדיום B27 בתוספת כפול SMAD. קוקטייל כפול SMAD עיכוב (10 μM TGFβ/פעילות מעכב Nodal ו-0.5 μM מעכב BMP) לקדם את האינדוקציה העצבית. החל מימים 4-11, לקדם התפשטות של רוזטות-נגזר מטות העצבים (לתוך התחומים), על ידי הוספת 10 ng/ml מקדם גידול באפידרמיס (egf) ו 10 ng/ml בסיסי מקדם הפיצוץ (bfgf) כדי בינונית B27 בתוספת עם קוקטייל dual-smad.הערה: ביום 11, רוב התאים צריכים להיות חיוביים עבור Nestin. מימים 11-13, תרבות הספירות בינונית B27 עם 0.5 מעכבי μM BMP. החל מימים 13-21, תרבות התחומים ב B27 בינוני בתוספת 10 ng/ml גליה נגזר neurotrophic פקטור (gdnf), 10 ng/ml המוח נגזר neurotrophic פקטור (bdnf) ו-1 μm של γ-הפרשה המדכא. GDNF ו-BDNF לקדם בידול עצבי וגליאל. מעכבי הγ-הסוד. מאפשרים התבגרות עצבית גדולה יותר ביום 21, צלחת התחומים (כ 1,000 כדורים) על קרום polyphilic הידרופילי (בקוטר 6 מ”מ, 0.4 μm) הופקד על לוחית התרבות הוספה שתוכננה עבור 6 היטב צלחת. הפסק סיבוב משלב זה. הנוכחות של rosettes, שנצפו עם מיקרוסקופ שדה בהיר, מצביעים על החניכה של בידול עצבי. רוזטות הנוירוטות עצביים ניתן לצפות 2-3 ימים לאחר הציפוי בספירות על קרום מצופפי. הוסף 1 מ ל של B27 בינוני בתוספת גורמי צמיחה מעכבי (כדלקמן) לכל טוב מתחת להוסיף קרום, כל 2-3 ימים (בדרך כלל ביום שני, רביעי ושישי), עבור שלושה שבועות הבאים של בידול. מימים 21-25, מטפחים אורגנואידים עצביים אנושיים באותה בינונית התבגרות עצבית (Cf. שלב 2.7.4). מימים 25-28, רק משלימים B27 בינונית עם 1 μM γ-הפרשה המעכב. החל מימים 28-39, הפסק להוסיף את המעכב הγ-הסודי והמשך בתרבות האנושית העצבית בB27 בינונית בלבד.הערה: לאחר 3 שבועות, האורגנואידים העצביים מוכנים לשימוש עבור השרשה הכולינרגיות. לאורך ההבשלה העצבית, ירידה של הסמן העצבי בלתי בוגר Nestin ועלייה של סמנים עצביים בוגרת β3-טובולין ו GFAP נצפו. 3. בידוד וטיפוח של תאים גלינובלסטומה (GICs) לבודד GICs על ידי מפרגיית ביופסיה של האדם בדרגה גבוהה. להעביר את פיסת הגידול בגביע המכיל 0.25% טריפסין ב 0.1 mM EDTA (4:1) ו לאט מערבבים ב 37 ° צ’ עבור 30-60 דקות (בהתאם לגודל הגידול). צלחת התאים המונתק ב 75 ס מ2 התרבות רקמה מבחנות מצופה בתאים 2500-5000 לכל ס מ בינוני כולינרגיות: dmem/F-12 בינוני (1:1) המכיל 1% N2, 1% B27, ו 1% 5 תוספי מזון (לטובת הישרדות כולינרגיות), שיושלם עם BFGF ו egf (שניהם ng/Ml, כדי לקדם שקידיות ו-1% של פניצילין/סטרפטומיצין. ברגע שהכולינרגיות היא מבוססת היטב וגוברת, להסיר את N2 ואת התוספים הראשונה של מדיום כולינרגיות. יום אחד לפני הוספת התאים על האורגאיד, הנתק את ה-GICs וספור אותם. לשטוף את צלחת המיקרוגל עם 2 מ ל של בינוני כולינרגיות ו צנטריפוגה את הצלחת במהירות המקסימלית כדי להסיר בועות (1000 x g). מניחים את GICs ב 1,000 תאים כדי לקבל אחד gliomasphere למיקרוגל. מודטה לילה ב 37 ° צ’ (איור 1C). שלב זה הוא המפתח ומאפשר GICs מכויל היטב (דוגמה של נקרוטיק ומעל GICs בגודל מעל מוצג באיור 2A,C). כדי ליזום הפלישה GBM, להוסיף gliomasphere אחד על גבי הרקמה העצבית עם טיפ גדול נשא pipet (איור 1F). מניחים בזהירות את 6 הצלחת בחזרה בחממה. 4. המיסק-מארגני הדואידים ללימודי משטרה יום 0: להגביר hESCs בתרבות 2D עד 60% שליטה (יום 0), ולאחר מכן להחליף מדיה תא גזע המשמש לשמירה על תכונות העוצמה של hESCs עם מדיום ללא סרום. התחל אינדוקציה עצבית על ידי להשלים את התרבות בינונית עם 0.5 μM BMP מעכבי ו 10 μM TGFβ/מעכב הפעלה/Nodal (קוקטייל כפול SMAD עיכוב), ולאחר מכן להוסיף 10 μM סלע מעכבי עבור 24 שעות כדי להגדיל את שיעור ההישרדות של תאים במהלך המעבר. יום 1: להכין את הצלחת המיקרוגל עם 2.5 mL לכל טוב של מדיום ללא סרום שיושלם עם 0.5 מעכב μM BMP, 10 μM TGFβ/פעילות מעכב Nodal, ו 10 μM סלע מעכב. כדי לציין את התאים לכיוון הדפוס הגחוני של הצינור העצבי, להוסיף 100 ng/mL סוניק קיפוד (ששש), 100 ng/mL פיברוהפיצוץ גורם הצמיחה 8 (FGF8), ו 2 μM smoothened agonist. צנטריפוגה את הצלחת (רק עם בינונית ובלי תאים) ב 1200 x g עבור 5 דקות כדי להסיר בועות אוויר מן המיקרוגל. לאחר יום 1 של האינדוקציה העצבית ב-2D, להסיר את המדיום ולשטוף במהירות עם PBS ללא Ca2 +/mgcl2 +. הנתק את המושבות בתאים בודדים ההשעיה על ידי הוספת 7.5 mL של הפתרון רקומביננטי אנזימטי T75 ס מ2 בקבוקון. מודטה עבור 2 דקות ב 37 ° c ולאחר מכן להשלים עם 7.5 mL של dמאמ-F12. לאסוף את ההשעיה התא ואת צנטריפוגה ב 300 x g עבור 5 דקות. להסיר את supernatant ולספור את התאים באותו מדיום המשמש להכנת צלחת המיקרוגל. כוונן את אמצעי האחסון הבינוני כדי לקבל השעיית תא המאפשר ליצור כדורי נוירולומטר המכילים 1000 תאים למיקרוגל (לדוגמה, לוח המיקרוגל המשמש כאן מכיל 4,700 למיקרוגל בצורה טובה). So, להכין 4,700,000 תאים ב 2.5 mL של בינוני ולהוסיף אותו הקודם 2.5 mL של בינונית כבר ממוקם בלוח. כדי להפיץ כראוי את התאים בכל המיקרוגל, לנענע בעדינות את הצלחת, ולצנטריפוגה את צלחת המיקרוגל 300 x g עבור 5 דקות. הצלחת ב 37 ° c עבור 24 שעות כדי ליצור כדורים. יום 2: לשטוף בעדינות את המיקרוגל עם המדיום ולאסוף ואז להעביר את הספירות בצלחת שש-באר שטופלו ברקמה. החלף את המדיום עם בינונית Neurobasal סיס שיושלם עם 1% B27, 1x NEAA, 2 מ”מ L-גלוטמין, ו 1% של פניצילין/סטרפטומיצין. בנוסף, להוסיף מרכיבי הרגליזציה ששש, FGF8, smoothened agonist, ו-dual-SMAD עיכוב מולקולות קטנות. המקום כדורים בסיבוב ב 37 ° צ’ (60 rpm, שייקר מסלולית) ולשנות חצי בינוני טרי בתוספת כל 2-3 ימים. יום 3: כדי לשפר את האינדוקציה העצבית להמיר ושלתי עצביים עם זהות מוחית בינונית, מוסף את המדיום עם 3 μM GSK-3β מעכב, אשר מפעיל את Wnt/β-catenin המסלול. לשמור על מעכבי GSK-3β במדיום עד יום 13. פיצול לשתי רקמה חדשה מטופלים 6 לוחות טוב כדי להפחית גם צפיפות הספירה למנוע צבירת כדור.הערה: ביום 8, רוב התאים צריכים להיות חיוביים עבור Nestin. יום 8: להתחיל את ההבשלה העצבית: להחליף את גורמי הרגליזציה שששש, FGF8, smoothened אגוניסט, ו-dual-SMAD הקוקטייל מעכבות עם 0.5 מ”מ מחנה diבוטיטור (כדי לזכות בהבשלה), 20 מעכב nM של de מחזור תא היציאה), 1 μM γ-הפרשה מעכב וגורמי גדילה, 10 ng/mL GDNF, 10 ng/mL BDNF, 1 ng/mL שינוי גורם הצמיחה β3 (TGFβ3), ו-5 ng/mL FGF20 (הן טובת הישרדות הקדמון DA). לשנות את המדיום כל 2-3 ימים. יום 21: ליצור את האורגאיד העצבי: הזרע סביב 100 נוירוספירות מתחת לתנאי ממשק נוזלי האוויר על ממברדת (בקוטר 6 מ”מ). העבר את הקרום לתוך לוחית התרבות (0.4 מ”מ) והוסף 1.2 mL של בינונית התבגרות עצבית משמש בידול נוירוספירה כפי שמתואר בעבר. הפסק סיבוב משלב זה. שנה את המדיום כל 2-3 ימים עד להשגת נקודת זמן הבידול הנדרשת.הערה: לגבי התבגרות עצבית, ירידה של סמן בלתי בוגר עצבי Nestin ועלייה של סמנים עצביים בוגרת β3-טובולין ו GFAP נצפו. הביטויים הגבוהים והNURR1 נצפו (איור 3C) ומאשרים את הבגרות האורגאידית העצבית11. 5. כימות הביטוי הגנטי ה-TH ו-Nurr1 לאימות של בידול הדואמנררגיות RNA החילוץ: על היום המצוין של בידול, lyse 40 נוירוספירות עם 350 μL של מאגר RLT (שסופקו בערכת החילוץ RNA) שיושלם עם 3.5 μL של 2-mercaptoethanol. לחלץ את ה-RNA מתוך כדורי נוירונט באמצעות ערכת הוצאת RNA לאחר הוראות היצרן. לכמת הכולל ריכוזי RNA. בצע שעתוק הפוכה של 300 ng של החילוץ הכולל RNA באמצעות ערכת תמלול הפוכה לתגובת שרשרת פולימראז כמותית בזמן אמת (qPCR) ובצע את הוראות היצרן. בצע ניתוח qPCR על מערכות זיהוי PCR בזמן אמת, בהתבסס על זיהוי cyanine צבען סימטרי. לנרמל את הנתונים עם גנים של משק הבית: גליצראלדהיד-3-פוספט דהידרוגנאז (הגנד) וגורם התארכות 1 אלפא (EF1). רצפי התחל מתוארים בטבלה 1. 6. זיהוי כרומטותרפיה בלחץ גבוה השתמש כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוה (בדיקות) עם זיהוי אלקטרוכימי כדי לזהות נוכחות של דופמין. דופמין הופק על ידי לאחר אורגנואידים נוירואידים ב 100 mL של 0.1 N perchloric חומצה (HClO4) עבור 15 דקות ב 4 ° c עם vortexing נמרצת כל 5 דקות. לאחר צנטריפוגה, לאסוף ולאחסן את סופרנטאנט ב-20 ° c עבור מינון דופמין. השתמש בעמודת C-18 (5 μm, 4.6 מ”מ x 150 מ”מ) כדי להפריד את האנליטים על-ידי הisocratic-שלב היפוך במצב הזרמה בקצב הזרימה של 1 mL/דקה. זיהוי של דופמין צריך להתבצע באמצעות גלאי קולון עם תא התניה להגדיר בפוטנציאל של + 200 mV. 7. הקלטת נתונים גולמיים עם פלטפורמת מיקרואלקטו (MEA) השתמש במיקרוסקופ לנתיחה כדי להעביר נוירוספירות למרכז של התקן הנקבוביות הנקבובי. השתמש במגבר ובמערכת רכישת נתונים עבור הקלטות אלקטרופיזיולוגיות. למדוד את היחס אות לרעש (SNR) כמו סטיית התקן של המתח במהלך 5 דקות הקלטה, באמצעות האות כמתח ממוצע שיא לשיא של קוצים שנרשמו באותו 5 תקופות דקות.