Beyin kanseri ve nörodejeneratif hastalıkların Incelenmesi için insan nöral Organoidler
Summary
Bu çalışmada, iki spesifik insan nöral organoidleri, insan sinirsel organoidlerin içinde sadece insanlarda ve 2) nöron dopaminerjik olarak eğitim için ilgili ve doğru bir model olarak 1) insan glioblastoma gelişimi türetmek için protokoller tanıtır ve açıklanmaktadır üç boyutlu bir organoid üreten farklılaşma.
Abstract
İlgili in vitro nöral modellerin eksikliği nöropatoloji için tıbbi ilerlemede önemli bir engeldir. İlgili hücresel modellerin kurulması, bu hastalıkların patolojik mekanizmalarını daha iyi anlamak ve yeni terapötik hedefleri ve stratejileri belirlemek için çok önemlidir. Uygun olmak için, bir in vitro model bir insan hastalığının patolojik özelliklerini çoğaltmak gerekir. Ancak, nörodejeneratif hastalık bağlamında, ilgili bir in vitro model değerli bir terapötik fırsat olarak nöral hücre değiştirme sağlamalıdır.
Böyle bir model sadece terapötik moleküllerin taramasına izin vermez ama aynı zamanda nöral protokol farklılaşması optimize etmek için kullanılabilir [Örneğin, Parkinson hastalığında transplantasyon bağlamında (PD)]. Bu çalışmada, insan sinirsel organoids (No) ve 2) nöron dopaminerjik (da) farklılaşma üç boyutlu (3D) organoid üreten içinde 1) insan glioblastoma gelişimi iki in vitro protokolleri açıklanmaktadır. Bu amaçla, insan embriyonik kök hücresi (hESC) farklılaşma elde edilen boyut kalibrasyonlu nörokürlerin üretimini sağlayan iyi standartlaştırılmış bir protokol kuruldu. İlk model, nöral nevuslardır içinde glioblastoma gelişimi sırasında meydana gelen moleküler ve hücresel olayları ortaya çıkarmak için kullanılabilir, da nevuslardır sadece Parkinson hastalığında hücre tedavisi için da nöronların uygun bir kaynak temsil değil, aynı zamanda olabilir ilaç testi için kullanılabilir.
Introduction
Dünya Sağlık Örgütü (WHO) düşük dereceli (sınıf ı II) veya yüksek dereceli (grade III ve IV) olarak astrositomları sınıflandırır. Glioblastoma multiforme (GBM) bir astrositom grade IV, primer beyin tümörlerinin en ölümcüldür, bu tedaviler tüm mevcut formları dayanıklıdır1. Nöroşirürji, kemoterapi ve radyoterapi dahil olmak üzere standart bakım tedavisine rağmen, GBM ölümcül kalır ve 15 aylık genel hayatta kalma oranı son 15 yıl2‘ de önemli ölçüde değişmemiştir. GBM patogenezini anlamada önemli ilerlemeler sağlamak için ilgili modellerin kullanımı anahtardır. Şimdiye kadar, GBM çalışma hücre hatları, kemirgen organottifik dilimleri ve fare veya transjenik fareler içine hasta türeyen hücrelerin ksenotransplantasyon güvenmiştir spontan tümörler geliştirmek3,4. Bu modeller beyin metastam ve tümör saldırganlık çalışması için yararlı olmasına rağmen, onlar türler arasında farklılıklar ile sınırlıdır, ve sonuç yanlış insan dokularına çevrilebilir olabilir. Dahası, insan hücreleri ile mevcut modeller de ana doku yokluğunda sınırlıdır/tümör etkileşimleri3,4. Deneysel modeller temel bilimin terapötik hedeflere çevirisi için önemlidir. Bu nedenle, GBM-başlatma hücreleri (Gıcs) ile birlikte kültürlü insan nöral organoidler üretmek için bir protokol açıklayan GBM gelişimi morfolojik ve fonksiyonel özellikleri taklit ilgili bir sistem sağlayabilir. Bu sistem, işgal hücrelerin ve nekroz alanlarının difüzör göçü gibi GBM gelişiminin bazı in vivo özelliklerini yeniden üretir ve tümör Biyolojisi ile ilgili gen ifadesini vurgular. Daha önce ortaya çıktığı gibi, bazı kritik MicroRNAs 3D sinir dokusu içinde GIC geliştirme sırasında indüklenir5,6.
PD büyük bir nörodejeneratif bozukluk ve multipl nöronal alt türleri7ile ilişkili. Belirtiler (örneğin, bradikezi, asimetrik dinlenme tremor, rijitlik ve duruş istikrarsızlık) Progressive başlangıçlı olsa bile, tam etiyolojisi açıkça kurulmaz. Nitekim, birçok çalışmada büyük risk faktörleri genetik ve çevresel faktörlerin bir arada neden olabilir kanıtlar vurgulandı. Parkinson belirtileri, dopaminergik nöronların bilateral dejenerasyonu ile ilişkilidir (sn), bu da striatum8,9‘ a yansıtılmaları için (da) aksonların kaybolmasına yol açan. Bu nedenle, striatal dopamin düzeylerinin azaltılması PD hastalarında motor fonksiyon bozukluğu ilerlemesi ile ilişkilidir. Dopaminerjik nöronlar tirozin hidroksilaz (TH) içerir, dopamin10için amino asit l-Tirozini l-3, 4-dihiddroxyphenylalanine (l-dopa, dopamin öncüsü) dönüştüren katekolaminergik nörotransmitter sentezinde anahtar bir enzim. TH proteini ifadesinde bir düşüş sonrasında ıncı aktivitesinin erken kaybı PD ‘nin bir damgasını oluşturur.
Bu çalışmada, insan nöral organoidleri kullanarak iki protokol açıklanmaktadır, özellikle TH-pozitif hücreler ile zenginleştirilmiş bir orta beyin benzeri fenotip doğru odaklı bir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokolün en önemli yönlerinden biri, hücre kültürü ve küreler ve nöral nevuslardır morfoloji yakın izlenmesi sırasında HESC pluripotency bakımı içerir. hESCs çok duyarlıdır ve her manipülasyon erken kontrolsüz farklılaşma yanı sıra hücre ölümü yol açabilir. Deneysel yeniden üretilebilirliği artırmak ve anormal karyotip olayların oluşumunu önlemek için, kromozom stabilitesini doğrulamadan sonra en düşük geçit sırasında birkaç hESCs toplu saklama tavsiye edilir. Dahası, her deneme için yeni bir şişe çözme ve hücrelerin davranışını her gün kontrol etmek için tavsiye edilir. Eğer küreler anormal yüksek boyutta daha az refraktif ise, muhtemelen toplama ve ölmek başlayacaktır.
Bu sistem üzerine bir gelişme ya perfüzyon ya da bir vaskülarize sistemi uygulama (endotel hücreleri ekleyerek veya bir 3D fluidik mikroçip içinde)12,13. Ancak, nöral nevuslardır kalınlığı kontrol (≤ 300 μm) oksijen ve besin verimli pasif perfüzyon sağlar ve nekroz önler. Başka bir gelişme bağışıklık hücrelerinin (microglia) giriş olduğunu. Bu sınırlamalar akılda, nöral organoids artı bir GıC sistemi çeşitli nedenlerle ilgili bir araç olabilir. İlk olarak, bu sistem ilaç taramasının bir terapötik bileşiğin bir nevuslardır veya tümör hücresini nasıl etkileyebileceğini izlemesine izin verir. İkincisi, hücre-hücre etkileşimleri incelenebilir ve bireysel ve toplu istilalar temel mikro-çevresel belirleyici görselleştirilebilir ve5,6,13keşfedilebilir.
Parkinson hastalığı bağlamında, da nöronlar içinde zenginleştirilmiş bir nöral nevuslardır hastalık gelişimini incelemek için ilgili ve doğru bir 3D modeli temsil edebilir. Önceki çalışmalarda, Parkinson hastalarına indüklenen pluripotent kök hücreleri da nöronlar doğru ayırt etkilenen nöronal alt türleri incelemek için kullanılmıştır. Dikkat, α-synuclein birikimi ve oksidatif strese duyarlılık gibi hastalıkla ilgili bazı fenotürleri14,15. Dahası, nöral nevuslardır terapötik molekülleri ekrana bir araç olarak kullanılabilir. Bununla birlikte, dopamin üretimi ve elektrofizyolojik aktivite gibi DA nöron hayatta kalma ve işlevselliğini değerlendirmek için belirli ve ilgili okumalar ayarlanmalıdır. Bu protokol, nöral organoidler oluşturmak için iki standart ve doğru kök hücre tabanlı yaklaşımlar sağlar.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar la Ligue Genevoise contre le Cancer (Cenevre, Isviçre), ıSREC Vakfı (Lozan, Isviçre) ve Clayton Araştırma Vakfı (Houston, TX, ABD) mali destek için teşekkür ederiz. Dahası, yazarlar, HES-HO ve Wyss merkezi mali destek için teşekkür ederiz. Krause ‘nin laboratuvarına yararlı tartışmalar ve destek ve Dr. Halah Kutaish ‘i proofreading için teşekkür ederiz.
Materials
| 6-well plate (6-well plate) | Falcon / Corning | 07-201-588 | |
| ABI Prism 7900 HT detection system (Real-Time PCR detection systems) | Applied Biosystems | Discontinued | |
| Aggrewell 400 (Microwell culture plates ) | StemCell Technologies | 34421 | |
| Amplifier (W2100-HS32) (Amplifier) | Multi Channel Systems | ||
| Anti-EGFR (phospho Y1101) antibody | Abcam | ab76195 | 1/100 dilution |
| Anti-GFAP Antibody | Dako | Z334 | 1/1000 dilution |
| Anti-Nestin, Human Antibody | Millipore | ABD69 | 1/400 dilution |
| Anti-Synapsin I Antibody | Chemicon | AB1543P | 1/500 dilution |
| B27 supplements (B27) | Life Technologies / Invitrogen | 1238 | For both protocol, stock solution 100x, final solution 1x |
| Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) | Cell Guidance | GFH1-2 | For both protocol, stock solution 100 µg/mL in pure H2O, final solution 20 ng/mL |
| CHIR-99021 (GSK-3β inhibitor ) | Axon Medchem | ct99021 | For Dopaminergic protocol, stock solution 7.5 mM in DMSO, final solution 3 µM |
| Compound E a γ–secretase inhibitor (γ–secretase inhibitor) | Calbiochem | CAS 209986-17-4 | For both protocol (gamma-secretase inhibitor XXI), stock solution 5 mM in DMSO, final solution 1 µM |
| Coulochem III (Coulometric detector parameters) | Thermo scientific | ||
| Dibutyryl cyclic-AMP (Dibutyryl cAMP) | Sigma | D0627 | For Dopaminergic protocol, stock solution 0.5 M in DMSO, final solution 0.5 mM |
| Dimethyl Sulfoxide Pure (DMSO) | Sigma-Aldrich | C6164 | Compounds solvent, ready to use |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 12491-015 | For cell culture, ready to use |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium Mixture F-12 (DMEM-F12) | Gibco | 11320033 | For cell culture, ready to use |
| EDTA 0.1 mM (EDTA) | Life Technologies | AM9912 | For cell culture, ready to use |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | Gibco | PHG0313 | For GIC culture, stock solution 100 µg/mL in pure H2O, final solution 10 ng/mL |
| Fibroblast Growth Factor 20 (FGF20) | Peprotech | 100-41 | For Dopaminergic protocol, stock solution 100 µg/mL in pure H2O, final solution 5 ng/mL |
| fibroblast growth factor 8 (FGF8) | Peprotech | GFH176-5 | For Dopaminergic protocol, stock solution 100 µg/mL in pure H2O, final solution 100 ng/mL |
| Fibroblast growth factor-basic (bFGF) | Gibco | PHG0024 | For GIC culture, stock solution 100 µg/mL in pure H2O, final solution 10 ng/mL |
| G5 supplements (G5) | Invitrogen | 17503012 | For GIC culture, stock solution 100x, final solution 1x |
| Glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF) | Cell Guidance | GFH2-2 | For both protocol, stock solution 100 µg/mL in pure H2O, final solution 20 ng/mL |
| Hydrophilic polytetrafluoroethylene membrane (PTFE membrane) | BioCell-Interface | Discontinued | |
| LDN-193189 (BMP inhibitor) | Axon Medchem /Stemgen | 04-0072-02 /1509 | Dual/Smad, stock solution 5 mM in DMSO, final solution 0.5 µM |
| L-glutamine (L-glutamine) | Gibco | 25030081 | L-Glutamine (200 mM), stock solution 200 mM, final solution 2 mM |
| Matrigel (extracellular matrix) | BD Biosciences | 354277 | hESC-qualified Matrix, stock solution 18-22 mg/mL, final solution 180-220 µg/mL |
| Millicell-CM Culture plate insert (0.4 µm) (Culture plate insert) | Millipore | PICM03050 | |
| Monoclonal Anti-β-Tubulin III antibody | Sigma | T8660 | 1/1000 dilution |
| MS Orbital Shaker, MS-NOR-30 (Orbital shaker) | Major Science | MS-NRC-30 | |
| N2 supplements (N2) | Invitrogen | 17502-048 | For GIC culture, stock solution 100x, final solution 1x |
| Nanodrop (Nanodrop) | Thermo Fisher Scientific | Discontinued | |
| Neurobasal (Neurobasal) | Life Technologies / Gibco | 21103049 | Maintenance and maturation embryonic neuronal cell populations , ready to use |
| Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Gibco | 11140 | Non-essential Amino Acids 100X, stock solution 100x, final solution 1x |
| Nurr1 Antibody (M-196) | Santa Cruz | Sc-5568 | 1/100 dilution |
| Nutristem (hESC medium ) | Biological Industries | 05-100-1A | Stem cell media, ready to use |
| Penicilin / Streptomycin (Penicilin / Streptomycin ) | Life Technologies / Gibco | 15140122 | For cell culture, stock solution 5 mg/mL, final solution 50 µg/mL |
| Perchloric acid 0.1N (HCLO4) | Merck | 100519 | For HPLC, ready to use |
| Phosphate Buffered Saline without Ca2+/Mg2+ (PBS without Ca2+/Mg2+ ) | Life Technologies | 14190250 | For cell culture, ready to use |
| PrimeScript RT-PCR Kit (Reverse transcription kit) | Takara | RR014A | |
| Purmorphamin (smoothened agonist) | Calbiochem | SML0868 | For Dopaminergic protocol, stock solution 10 mM in DMSO, final solution 2 µM |
| Rho-associated Kinase Y-27632 (ROCK) | Abcam Biochemicals | ab120129-1 | Rock Inhibitor, stock solution 50 mM in DMSO, final solution 10 µM |
| RNeasy mini kit (RNA extraction kit ) | Qiagen | 74104 | |
| SB-431542 (TGFβ/Activin/Nodal inhibitor ) | Ascent | Asc- 163 | Dual-Smad, stock solution 50 mM in DMSO, final solution 10 µM |
| Sonic Hedgehog (SHH) | Cell Guidance | GFH168-5 | For Dopaminergic protocol, stock solution 100 µg/mL in pure H2O, final solution 100 ng/mL |
| StemPro Accutase (hESC enzymatic solution) | Gibco | A11105-01 | hESC enzymatic solution, ready to use |
| Symmetry C-18,5 mm (4.6 150mm2) (Reversed-phase column) | Waters Corporation | ||
| T150 flask (T150 flask) | Falcon | 08-772-1F | |
| TH Antibody (F-11) | Santa Cruz | Sc-25269 | 1/200 dilution |
| Transforming Growth Factors beta 3 (TGFβ3) | Cell Guidance | GFH109-2 | For Dopaminergic protocol, stock solution 100 µg/mL in pure ethanol , final solution 1 ng/mL |
| Trichostatine A (inhibitor of histone deacetylase ) | Sigma | T8552 | For Dopaminergic protocol, stock solution 100 µM in DMSO, final solution 20 nM |
| TrypLE (recombinant enzymatic solution) | Invitrogen | 12604021 | recombinant enzymatic solution, ready to use |
| Trypsin 0.25% (enzymatic solution) | Life Technologies | 15050065 | enzymatic solution, ready to use |
| W2100, Multi Channel Systems (Data acquisition system ) | WAT045905 | ||
| X-vivo (serum free medium) | Lonza | BE04-743Q | serum free medium, ready to use |
References
- Louis, D. N., et al. The 2016 World Health Organization Classification of Tumors of the Central Nervous System: a summary. Acta Neuropathologica. 131 (6), 803-820 (2016).
- Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. New England Journal of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).
- Daphu, I., et al. In vivo animal models for studying brain metastasis: value and limitations. Clinical and Experimental Metastasis. 30 (5), 695-710 (2013).
- Huszthy, P. C., et al. In vivo models of primary brain tumors: pitfalls and perspectives. Neuro Oncology. 14 (8), 979-993 (2012).
- Nayernia, Z., et al. The relationship between brain tumor cell invasion of engineered neural tissues and in vivo features of glioblastoma. Biomaterials. 34 (33), 8279-8290 (2013).
- Cosset, E., et al. Human tissue engineering allows the identification of active miRNA regulators of glioblastoma aggressiveness. Biomaterials. 107, 74-87 (2016).
- Pringsheim, T., Jette, N., Frolkis, A., Steeves, T. D. The prevalence of Parkinson’s’s disease: a systematic review and meta-analysis. Movement Disorders. 29 (13), 1583-1590 (2014).
- Rajput, A. H., et al. Globus pallidus dopamine and Parkinson’s motor subtypes: clinical and brain biochemical correlation. Neurology. 70 (16 Pt 2), 1403-1410 (2008).
- Jellinger, K. A. Pathology of Parkinson’s’s disease. Changes other than the nigrostriatal pathway. Molecular and Chemical Neuropathology. 14 (3), 153-197 (1991).
- Bernheimer, H., Birkmayer, W., Hornykiewicz, O., Jellinger, K., Seitelberger, F. Brain dopamine and the syndromes of Parkinson’s and Huntington. Clinical, morphological and neurochemical correlations. Journal of Neurological Science. 20 (4), 415-455 (1973).
- Tieng, V., et al. Engineering of midbrain organoids containing long-lived dopaminergic neurons. Stem Cells and Development. 23 (13), 1535-1547 (2014).
- Chen, C. S. 3D Biomimetic Cultures: The Next Platform for Cell Biology. Trends in Cell Biology. 26 (11), 798-800 (2016).
- Friedl, P., Sahai, E., Weiss, S., Yamada, K. M. New dimensions in cell migration. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (11), 743-747 (2012).
- Byers, B., et al. SNCA triplication Parkinson’s’s patient’s iPSC-derived DA neurons accumulate alpha-synuclein and are susceptible to oxidative stress. PLoS ONE. 6 (11), e26159 (2011).
- Flierl, A., et al. Higher vulnerability and stress sensitivity of neuronal precursor cells carrying an alpha-synuclein gene triplication. PLoS ONE. 9 (11), e112413 (2014).
