Organoïdes neuronaux humains pour étudier le cancer du cerveau et les maladies neurodégénératives

Ce protocole suit les directives du comité d’éthique de la recherche humaine de l’Université de Genève. 1. Entretien et culture de cellules souches embryonnaires humaines indifférenciées (HESC) Effectuer l’entretien et l’expansion des HSEC dans des conditions sans mangeoire en pré-enrobant les plats avec une matrice extracellulaire spécifique. Décongeler 300 oL de matrice extracellulaire à 4 oC (concentration de portée typique 18-22 mg/mL, garder sur la glace) et mélanger délicatement avec 15 ml de milieu DMEM froid pour éviter une gélation prématurée de la matrice extracellulaire. Ajouter 7,5 ml du matrique extracellulaire aux deux flacons T150. Incuber les plats recouverts d’une matrice extracellulaire à 37 oC pendant au moins 1 h (maximum pendant la nuit). Enlever le milieu et les hESC sémineux à une densité de 6,5 x 104 cellules/cm2. Maintenir H1 (ligne cellulaire hESC) dans le milieu hESC et 1% pénicilline/streptomycine. Passer les cellules avec une procédure enzymatique: ajouter 7,5 ml de solution enzymatique à un flacon T75 cm2 sur une période de 1-2 min à 37 oC. Une fois les cellules complètement détachées, ajouter 7,5 ml de DMEM-F12, puis centrifugeuse pendant 5 min à 300 x g. Pour permettre une meilleure survie, re-plaquer les cellules à la densité désirée sur des plats extracellulaires recouverts de matrice, dans le même milieu contenant l’inhibiteur de la kinase protéine Rho-associée (ROCK) (10 ‘M) pendant 24 h. 2. organoïdes neuronaux dérivés du hESC pour les études sur la GBM 24 h avant de commencer la culture 3D, remplacer le milieu hESC par un milieu sans sérum complété par un inhibiteur de 10 M ROCK (les deux composants sont nécessaires pour soutenir la survie cellulaire et la formation spontanée de neurosphère pendant la phase d’agrégation dans un micropuits plaque). Les cellules doivent être à 60% de confluence. Le lendemain (jour 0), détachez les colonies de hESC en cellules simples : retirez le milieu, puis rincez avec du PBS sans Ca2/Mg2,ajoutez 5 mL de solution de dissolution enzymatique, et incubez à 37 oC pendant 1-2 min. Recueillir les cellules dans un milieu sans sérum avec 10 Md d’inhibiteur ROCK et centrifuger les cellules à 300 x g pendant 5 min. Enlevez le supernatant et comptez les cellules dans 10 ml de milieu sans sérum complété par 10 m d’inhibiteur ROCK. En parallèle, rincer la plaque de micropuits avec 2 ml de milieu sans sérum par puits et centrifuger la plaque à 1200 x g pendant 5 min pour enlever toutes les bulles, ce qui peut empêcher la formation de neurosphère. Préparer 28,2 x 106 de cellules dans 12,5 ml de milieu sans sérum complété par un inhibiteur de 10 M ROCK. Distribuer 1000 cellules/micropuits. Centrifuger les cellules à 300 x g pendant 5 min et placer la plaque dans l’incubateur à 37 oC pendant la nuit (maximum 36 h). Par exemple : pour obtenir 30 organoïdes neuronaux humains, utilisez un flacon T150 à 70 % à 80 % de la confluence (environ 30 millions de cellules). Le lendemain (jour 1), collectez les sphères (avec un P1000) et placez-les dans une plaque de 6 puits. Dans chaque puits, ajouter 2 ml de milieu B27 et d’acide GlutaMAX et Neurobasal (mélange à 1:1), complété par 1 % de suppléments B27 et 1 % d’acides aminés non essentiels (NEAA). Pour favoriser l’induction neuronale rapide, complétez le milieu par un cocktail d’inhibition double-SMAD, composé d’un inhibiteur de 10 M TGGMD/Activin/Nodal et d’un inhibiteur de la protéine morphogène osseuse (BMP) de 0,5 M. A partir de ce pas en avant, les sphères sont cultivées en rotation (60 tr/min, shaker orbital). La rotation est essentielle pour empêcher les sphères de coller ensemble ou à la plaque. Changer le milieu tous les 2-3 jours: plier la plaque et laisser les sphères tomber pendant 5 min, enlever la moitié du milieu (2 ml), et ajouter 2 ml de B27 moyen frais complété par des facteurs de croissance et des inhibiteurs. Ne pas centrifuger les sphères. Effectuer l’induction neuronale selon le cours de temps suivant : Du jour 1-4, la culture des sphères dans Le milieu B27 complété par dual-SMAD. Le cocktail d’inhibition dual-SMAD (10 ‘M Inhibiteur TGF/Activin/Nodal et inhibiteur de 0,5 M BMP) favorise l’induction neuronale. Des jours 4-11, favorisez la prolifération des rosettes neurales hESC-dérivées (dans les sphères), en ajoutant le facteur épidermique de 10 ng/mL (EGF) et le facteur de fibroblaste de base de 10 ng/mL (bFGF) au milieu de B27 complété avec le cocktail dual-SMAD.REMARQUE : Le jour 11, la plupart des cellules devraient être positives pour Nestin. Du jour 11-13, la culture des sphères dans le milieu B27 complété par un inhibiteur de 0,5 M BMP. Des jours 13-21, culture les sphères dans le milieu de B27 complétés avec 10 ng/mL facteur neurotrophique dérivé de glial (GDNF), 10 ng/mL facteur neurotrophique dérivé de cerveau (BDNF) et 1 M m de l’inhibiteur de la sécréase. GDNF et BDNF favorisent la différenciation neuronale et gliale. L’inhibiteur de la sécrétase permet une plus grande maturation neuronale. Le jour 21, plaquer les sphères (environ 1 000 sphères) sur une membrane hydrophile de polytétrafluoroéthylène (PTFE) (6 mm de diamètre, 0,4 m) déposée sur un insert de plaque de culture conçu pour 6 plaques de puits. Arrêtez toute rotation à partir de cette étape. La présence de rosettes, observée avec un microscope lumineux, indique l’initiation de la différenciation neuronale. Les rosettes neurales peuvent être observées 2-3 jours après des sphères de placage sur la membrane de PTFE. Ajouter 1 ml de milieu B27 complété par des facteurs de croissance et des inhibiteurs (comme suit) à chaque puits sous l’insert de membrane, tous les 2-3 jours (généralement le lundi, le mercredi et le vendredi), pour les 3 semaines suivantes de différenciation. Des jours 21-25, cultivez les organoïdes neuronaux humains dans le même milieu de maturation neural (Cf. étape 2.7.4). Du 25 au 28 jours, ne compléter le milieu B27 qu’avec un inhibiteur de 1 M de sécrétase. À partir des jours 28-39, arrêtez d’ajouter l’inhibiteur de la sécrétase et continuez la culture d’organoïdes neuronaux humains dans le milieu B27 seulement.REMARQUE : Après 3 semaines, les organoïdes neuronaux sont prêts à l’emploi pour l’implantation de GIC. Le long de la maturation neurale, une diminution du marqueur immature neural Nestin et l’augmentation des marqueurs neuronaux mûrs -3-tubulin et GFAP ont été observées. 3. Isolement et culture des cellules initiatrices du glioblastome (CPG) Isolez les CPG en fragmentant une biopsie humaine de GBM de haute qualité. Transférer le morceau de tumeur dans un bécher contenant 0,25% de trypsine dans 0,1 mM EDTA (4:1) et remuer lentement à 37 oC pendant 30-60 min (selon la taille de la tumeur). Plaquer les cellules dissociées dans des flacons de culture tissulaire de 75 cm2 plaqués à 2 500 à 5 000 cellules par cm2 dans le milieu du GIC : milieu DMEM/F-12 (1:1) contenant 1 % De N2, 1 % De B27 et 1 % de suppléments G5 (pour favoriser la survie du GIC), complétés par bFGF et EGF (tous deux à 10 ng/Ml, pour favoriser la séminité) et 1% de pénicilline/streptomycine. Une fois que le CPG est bien établi et en croissance, retirer les suppléments N2 et G5 du milieu du CPG. Un jour avant d’ajouter les cellules sur l’organoïde, dissocier les CPG et les compter. Rincer la plaque micropuits avec 2 ml de milieu de GIC et centrifuger la plaque à la vitesse maximale pour enlever les bulles (1000 x g). Placez les CPG à 1 000 cellules pour obtenir une gliomasphère par micropuits. Incuber toute la nuit à 37 oC (figure1C). Cette étape est essentielle et permet des CPG bien calibrés (un exemple de CPG nécrotiques et surdimensionnés est montré dans la figure 2A,C). Pour initier l’invasion de GBM, ajoutez une gliomasphère au-dessus du tissu neural avec une grande pointe de tuyauterie de perle (figure 1F). Placer délicatement la plaque de 6 puits dans l’incubateur. 4. organoïdes dopaminergiques dérivés du HESC pour les études sur la Jour 0: Amplifiez les HESC dans la culture 2D jusqu’à 60% de confluence (jour 0), puis remplacez les milieux de cellules souches utilisés pour maintenir les caractéristiques de la pluripotence des HESC par un milieu sans sérum. Démarrer l’induction neuronale en complétant le milieu de culture avec un inhibiteur de 0,5 M BMP et 10 ‘M Inhibiteur TGGMD/Activin/Nodal (cocktail d’inhibition dual-SMAD), puis ajoutez 10 ‘M inhibiteur de ROCK pendant 24 h pour augmenter le taux de survie des cellules pendant le passage. Jour 1 : Préparer la plaque de micropuits avec 2,5 ml par puits de milieu sans sérum complété par un inhibiteur de 0,5 M BMP, 10 ‘M inhibiteur TGGM/Activin/Nodal, et 10 ‘M inhibiteur de ROCK. Pour spécifier les cellules vers le modèle ventral du tube neural, ajoutez 100 ng/mL Sonic Hedgehog (SHH), 100 ng/mL fibroblaste facteur de croissance 8 (FGF8), et 2 ‘M agoniste lissé. Centrifuger la plaque (seulement avec moyen et sans cellules) à 1200 x g pendant 5 min pour enlever les bulles d’air des micropuits. Après 1 jour d’induction neuronale en 2D, retirer le milieu et laver rapidement avec du PBS sans Ca2/MgCl2 . Dissocier les colonies en suspension de cellules individuelles en ajoutant 7,5 ml de solution enzymatique recombinante dans un flacon T75 cm 2. Incuber pendant 2 min à 37 oC puis compléter avec 7,5 ml de DMEM-F12. Recueillir la suspension cellulaire et la centrifugeuse à 300 x g pendant 5 min. Retirez le supernatant et comptez les cellules dans le même milieu utilisé pour préparer la plaque de micropuits. Ajuster le volume moyen pour obtenir une suspension cellulaire permettant de former des neurosphères contenant 1000 cellules par micropuits (par exemple, la plaque de micropuits utilisée ici contient 4 700 micropuitss par puits). Préparer donc 4,7 millions de cellules dans 2,5 ml de milieu et l’ajouter aux 2,5 ml de milieu antérieur s’est déjà placé dans la plaque. Afin de répartir correctement les cellules dans chaque micropuits, agitez doucement la plaque et centrifugez la plaque de micropuits 300 x g pendant 5 min. Incuber la plaque à 37 oC pendant 24 h pour générer des sphères. Jour 2 : Rincer délicatement les micropuits avec le milieu et recueillir, puis transférer les sphères dans une plaque de six puits traitée par les tissus. Remplacer le milieu par neurobasal milieu complété par 1% B27, 1x NEAA, 2 mM L-glutamine, et 1% de pénicilline / streptomycine. En outre, ajoutez des facteurs de régionalisation SHH, FGF8, agoniste lisse, et double-SMAD inhibition de petites molécules. Placer les sphères en rotation à 37 oC (60 tr/min, shaker orbital) et changer de demi-moyen fraîchement complété tous les 2-3 jours. Jour 3 : Pour améliorer l’induction neuronale et les convertir en progéniteurs neuronaux avec une identité cérébrale, complétez le milieu par un inhibiteur de 3 M GSK-3, qui active la voie Wnt/-caténine. Maintenir l’inhibiteur GSK-3MD dans le milieu jusqu’au jour 13. Diviser en deux nouvelles plaques de puits traitées par les tissus pour réduire la densité de la sphère par puits et éviter l’agrégation de sphère.REMARQUE : Au jour 8, la plupart des cellules devraient être positives pour Nestin. Jour 8: Démarrer la maturation neuronale: remplacer les facteurs de régionalisation SHH, FGF8, agoniste lissé, et cocktail d’inhibition dual-SMAD avec 0,5 mM dibutyryl cAMP (pour favoriser la maturation), 20 nM inhibiteur de l’histone deacetylase (pour la sortie du cycle cellulaire), 1 M -sécrétase facteurs inhibiteurs et de croissance, 10 ng/mL GDNF, 10 ng/mL BDNF, 1 ng/mL transformant le facteur de croissance 3 (TGF-3), et 5 ng/mL FGF20 (les deux favorisent la survie de l’ancêtre DA). Changer le milieu tous les 2-3 jours. Jour 21: Générer l’organoïde neural: graines autour de 100 neurosphères sous des conditions d’interface air-liquide sur la membrane PTFE (6 mm de diamètre). Transférer la membrane à un insert de plaque de culture (0,4 mm) et ajouter 1,2 ml de milieu de maturation neuronale utilisé pour la différenciation de la neurosphère telle que décrite précédemment. Arrêtez toute rotation à partir de cette étape. Changez le milieu tous les 2-3 jours jusqu’à ce que le point de différenciation requis soit atteint.REMARQUE : En ce qui concerne la maturation neuronale, une diminution du marqueur immature neural Nestin et l’augmentation des marqueurs neuronaux matures 3-tubulin et GFAP ont été observées. Des expressions TH et NURR1 élevées ont été observées (Figure 3C) et confirment la maturité organoïde neurale11. 5. Quantification de l’expression du gène TH et Nurr1 pour la validation de la différenciation dopaminergique Extraction de l’ARN : Le jour indiqué de la différenciation, lysez 40 neurosphères avec 350 L de tampon RLT (fourni dans le kit d’extraction d’ARN) complétée par 3,5 l de 2-mercaptoethanol. Extraire l’ARN des neurosphères lysées à l’aide d’un kit d’extraction d’ARN suivant les instructions du fabricant. Quantifier les concentrations totales d’ARN. Effectuer la transcription inverse de 300 ng de l’extraction totale de l’ARN à l’aide du kit de transcription inversée pour la réaction quantitative en temps réel de la chaîne de polymérase (qPCR) et suivre les instructions du fabricant . Effectuer une analyse qPCR sur les systèmes de détection PCR en temps réel, basé sur la détection asymétrique de colorant cyanine. Normalisez les données avec des gènes d’entretien ménager : glycéraldéhyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) et facteur d’allongement 1-alpha (EF1). Les séquences d’amorces sont décrites dans le tableau 1. 6. Détection de la chromatographie liquide à haute pression (HPLC) Utilisez la chromatographie liquide à haute pression (HPLC) avec détection électrochimique pour détecter la présence de dopamine. La dopamine a été extraite en lysant les organoïdes neuronaux dans 100 ml d’acide perchlorique de 0,1 N (HClO4) pendant 15 min à 4 oC avec un tourbillon vigoureux toutes les 5 min. Après la centrifugation, recueillir et stocker le supernatant à -20 oC pour la dose de dopamine. Utilisez une colonne C-18 (5 m, 4,6 mm x 150 mm) pour séparer les analytes en HPLC en phase inversée en mode isocratique à un débit de 1 ml/minute. La détection de la dopamine doit être effectuée à l’aide d’un détecteur coulométrique avec la cellule de conditionnement fixée à un potentiel de 200 mV. 7. Enregistrement brut de données avec la plate-forme de tableau de micro-electode (MEA) Utilisez un microscope à dissection pour transférer les neurosphères au centre d’un dispositif MEA poreux. Utilisez un amplificateur et un système d’acquisition de données pour les enregistrements électrophysiologiques. Mesurer le rapport signal-bruit (RNS) comme déviation standard de la tension au cours d’un enregistrement de 5 minutes, en utilisant le signal comme la tension moyenne de pointe à pic des pics enregistrés dans les mêmes périodes de 5 minutes.