Человеческие нейронные органоиды для изучения рака мозга и нейродегенеративных заболеваний

Этот протокол соответствует руководящим принципам комитета по этике человеческих исследований Университета 1. Поддержание и культура недифференцированных эмбриональных стволовых клеток человека (HESC) Выполняйте техническое обслуживание и расширение HSECs на условиях без фидера, предварительно покрывая посуду с помощью специальной внеклеточной матрицы. Оттепель 300 кл внеклеточной матрицы при 4 градусах Цельсия (типичная концентрация диапазона 18-22 мг/мл, держитесь на льду) и аккуратно перемешайте с 15 мл холодной среды DMEM, чтобы избежать преждевременного гелирования внеклеточной матрицы. Добавьте 7,5 мл внеклеточного матрика к обеим колбам T150. Инкубировать блюда, покрытые внеклеточной матрицы на 37 градусов по Цельсию, по крайней мере 1 ч (максимум за одну ночь). Удалите средние и семенные hESCs с плотностью 6,5 х 104 ячейки /см2. Поддержание H1 (линия клеток hESC) в среде hESC и 1% пенициллина/стрептомицина. Передайте клетки с помощью ферментативной процедуры: добавьте 7,5 мл ферментативного раствора в колбу T75 см2 в течение 1-2 мин при 37 градусах По Цельсию. После того, как клетки полностью отделены, добавьте 7,5 мл DMEM-F12, затем центрифугу в течение 5 мин при 300 х г. Для обеспечения лучшего выживания, повторно пластины клеток при желаемой плотности на внеклеточной матричной посуды, в той же среде, содержащей Rho-связанных белка киназы (ROCK) ингибитор (10 мкм) для 24 ч. 2. hESC полученных нервных органоидов для исследований GBM 24 ч перед началом 3D-культуры замените среду hESC средой, свободной от сыворотки, дополненной ингибитором 10 км ROCK (оба компонента необходимы для поддержки выживания клеток и спонтанного формирования нейросферы во время фазы агрегации в микроколодце тарелка). Клетки должны быть на 60% внештатной. На следующий день (день 0), отсоединить колонии hESC в виде одиночных клеток: удалить среду, затем промыть PBS без Ca2’/Mg2″, добавить 5 мл ферментативного раствора раствора раствора раствора раствора раствора раствора раствора, и инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение 1-2 мин. Соберите клетки в среде, свободной от сыворотки, с 10 мкм ингибитора ROCK и центрифуги клетки на 300 х г в течение 5 мин. Удалить супернатант и рассчитывать клетки в 10 мл сыворотки свободной среде дополняется 10 мкм ингибитора ROCK. Параллельно промыть микроскважину с 2 мл среды без сыворотки в скважину и центрифуги пластины на 1200 х г в течение 5 минут, чтобы удалить все пузырьки, которые могут предотвратить образование нейросферы. Приготовьте 28,2 x 106 клеток в 12,5 мл среды, свободной от сыворотки, дополненной 10 ингибитором rock. Распределить 1000 клеток/микровелл. Центрифуге клетки на 300 х г в течение 5 мин и поместите пластину в инкубатор на 37 градусов по Цельсию на ночь (максимум 36 ч). Например: чтобы получить 30 человеческих нервных органоидов, используйте одну колбу T150 при 70%-80% слияния (около 30 млн клеток). На следующий день (день 1), соберите сферы (с P1000) и поместите их в 6 хорошо пластины. В каждую скважину добавьте 2 мл средней и DMEM-F12 GlutaMAX и нейробазальной среды (смесь на 1:1), дополненной 1% добавками B27 и 1% несущественными аминокислотами (NEAA). Для содействия быстрой нервной индукции, дополнить среду с двойным-SMAD ингибирование коктейль, состоящий из 10 мКм TGF /Актив/Нодал ингибитор и 0,5 мкм костной морфогенный белок (BMP) ингибитор. С этого шага вперед сферы культивируются в вращении (60 об/мин, орбитальный шейкер). Вращение имеет решающее значение для предотвращения сферы от слипания или пластины. Изменение среды каждые 2-3 дня: согнуть пластину и пусть сферы падают на 5 мин, удалить половину среды (2 мл), и добавить 2 мл свежей среды B27 дополнены факторами роста и ингибиторами. Не центрифугис сферы. Выполните нейроиндукцию в соответствии со следующим курсом времени: С 1-4 дней культура сфер в среде B27 дополнена двойным SMAD. Коктейль-ингибирование двойного SMAD (10 мкм TGF/Актив/Ингибитор Nodal и ингибитор БМП 0,5 мкм) способствует индукции нейронов. С 4-11 дней, способствовать распространению hESC полученных нейронных розеток (в сферах), добавив 10 нг / мЛ эпидермального фактора роста (EGF) и 10 нг / мл основной фибробластный фактор (bFGF) в B27 среднего дополнены двойной SMAD коктейль.ПРИМЕЧАНИЕ: На 11-й день, большинство клеток должны быть положительными для Nestin. С 11-13 дней культура сфер в среде B27 дополнена ингибитором БМП 0,5 мкм. С 13-21 дней, культура сфер в B27 среде дополнены 10 нг /мл глиальных производных нейротрофический фактор (GDNF), 10 нг /мЛ мозга производных нейротрофический фактор (BDNF) и 1 Км ингибитора З-секретазы. GDNF и BDNF способствуют дифференциации нейронов и глиальных. Ингибитор кесекретари обеспечивает большее созревание нейронов. На 21 день наклеить сферы (около 1000 сфер) на гидрофильные политетрафториленовые (PTFE) мембраны (диаметр 6 мм, 0,4 мкм), отложенные на вставке пластины культуры, рассчитанной на 6 скважинную пластину. Остановите любое вращение с этого шага. Наличие розеток, наблюдаемых с помощью ярко-поляного микроскопа, указывает на начало нейронной дифференциации. Нейронные розетки можно наблюдать через 2-3 дня после покрытия сфер на мембране PTFE. Добавьте 1 мл средней b27, дополненной факторами роста и ингибиторами (как следует) к каждому колодцу под мембранной вставкой, каждые 2-3 дня (обычно в понедельник, среду и пятницу) в течение следующих 3 недель дифференциации. Начиная с 21-25 дней, культивировать человеческие нервные органоиды в той же среде созревания нейронов (Cf. шаг 2.7.4). С 25-28 дней, только дополнить B27 среды с 1 ММ-секретазы ингибитор. С 28-39 дней, прекратить добавление ингибитора к-секретазы и продолжить человека нервной органоидной культуры в B27 среде только.ПРИМЕЧАНИЕ: После 3 недель, нервные органоиды готовы к использованию для имплантации ГИК. Вдоль нейронного созревания наблюдалось уменьшение нервного незрелого маркера Nestin и увеличение зрелых нервных маркеров З3-тубулин и GFAP. 3. Изоляция и культивирование клеток, инициирующих глиобластому (ГИК) Изолировать ГИК путем фрагментации высококачественной биопсии ГБМ человека. Перенесите кусок опухоли в стакан, содержащий 0,25% трипсина в 0,1 мМ EDTA (4:1) и медленно перемешайте при 37 градусах По Цельсию в течение 30-60 мин (в зависимости от размера опухоли). Плита диссоциированных клеток в 75 см2 ткани культуры колбы покрытием на 2500-5000 клеток на см2 в среде GIC: DMEM / F-12 среды (1:1), содержащий 1% N2, 1% B27, и 1% G5 добавки (в пользу выживания GIC), дополнены bFGF и EGF (оба на 10 нг/Мл, для содействия стеблю) и 1% пенициллина/стрептомицина. После того, как GIC хорошо зарекомендовал себя и растет, удалить N2 и G5 добавки из среды GIC. За день до добавления клеток на органоид, разъединить ГИК и считать их. Промыть микроскважину с 2 мл Среднего ГИК и центрифуги пластины на максимальной скорости, чтобы удалить пузырьки (1000 х г). Поместите ГИК на 1000 клеток, чтобы получить одну глиомасферу на микроскважину. Инкубировать ночь при 37 градусов по Цельсию(рисунок 1C). Этот шаг является ключевым и позволяет хорошо откалиброванные ГИК (пример некротики и негабаритных ГИК показано на рисунке 2A,C). Чтобы инициировать вторжение GBM, добавьте одну глиомасферу поверх нервной ткани с большим наконечником пропорот(рисунок 1F). Аккуратно поместите 6 хорошо пластины обратно в инкубатор. 4. hESC полученных дофаминергических органоидов для исследований PD День 0: Усилите hESCs в 2D культуре до 60% confluency (день 0), после этого заменить средства стволовой клетки используемые для поддержания функций pluripotency hESCs с сывороточной свободной средой. Начните нейроиндукцию, дополняя среду культуры ингибитором 0,5 мкм БМП и 10 мкм TGF/Актив/Ингибитор для нодал (коктейль-ингибирование двойного SMAD), затем добавьте ингибитор 10 мКМ ROCK в течение 24 ч, чтобы увеличить выживаемость клеток во время прохождения. День 1: Подготовьте микроскважинную пластину с 2,5 мл на скважину среды, свободной от сыворотки, дополненной ингибитором БМП 0,5 мкм, 10 мкм ТГФ/Актививин/Нодальный ингибитор, и ингибитор омрок. Чтобы указать клетки к брюшной схеме нервной трубки, добавьте 100 нг/мл Соника Ежика (SHH), 100 нг/мл фибробластного фактора роста 8 (FGF8) и 2 мКм сглаженного агониста. Центрифуги пластины (только со средними и без клеток) на 1200 х г в течение 5 минут, чтобы удалить пузырьки воздуха из микровелл. После 1 дня нервной индукции в 2D, удалить среду и быстро мыть с PBS без Ca2″/MgCl2 “. Разъедините колонии в одноклеточных подвесках, добавив 7,5 мл рекомбинантного ферментативного раствора в колбу T75 см 2. Инкубировать в течение 2 мин при 37 градусах по Цельсию, затем в комплекте с 7,5 мл DMEM-F12. Соберите суспензию клетки и центрифугу при 300 х г в течение 5 мин. Удалите супернатант и посчитайте клетки в той же среде, используемой для подготовки микроколодца пластины. Отрегулируйте средний объем, чтобы получить клеточную суспензию, позволяющую образовывать нейросферы, содержащие 1000 клеток на микроскважину (например, микроскважинная пластина, используемая здесь, содержит 4700 микровелл на скважину). Так, приготовьте 4,7 млн ячеек в 2,5 мл средней и добавьте ее к прежним 2,5 мл среды, уже помещенной в пластину. Для того, чтобы правильно распределить клетки в каждом микроколодце, аккуратно встряхните пластину, и центрифуги микроуэлл аплиты 300 х г в течение 5 мин. Инкубировать пластину при 37 градусах Цельсия в течение 24 ч для генерации сфер. День 2: Аккуратно промыть микровеллы со средой и собирать затем передать сферы в ткани обработанных шестиколодцв пластины. Замените среду нейробазальной средой, дополненной 1% B27, 1x NEAA, 2 мМ L-глютамином и 1% пенициллина/стрептомицина. Кроме того, добавьте факторы регионализации SHH, FGF8, сглаженную агонист, и двойное sMAD ингибирование малых молекул. Поместите сферы в вращение при 37 градусах По Цельсию (60 об/мин, орбитальный шейкер) и меняйте полусредние свежедомесячные каждые 2-3 дня. День 3: Для повышения нервной индукции и преобразования в нейронных прародителей с среднего мозга идентичности, дополнить среду с 3 мкм ГСК-3 “ингибитор, который активирует Wnt / й-катенин пути. Поддерживайте ингибитор ГСК-3 в среде до 13-го дня. Разделите на две новые ткани обработанных 6 скважинных пластин, чтобы уменьшить плотность обеих сфер на скважину и избежать агрегации сферы.ПРИМЕЧАНИЕ: На 8-й день, большинство клеток должны быть положительными для Nestin. День 8: Начало нейронного созревания: заменить факторы регионализации SHH, FGF8, сглаженный агонист, и двойной SMAD ингибирование коктейль с 0,5 мМ дибутырила cAMP (в пользу созревания), 20 нМ ингибитор гистон деацетилазы (для выхода из клеточного цикла), 1 мкм факторы ингибитора и роста, 10 нг/мл GDNF, 10 нг/мл BDNF, 1 нг/мл, трансформирующий фактор роста No3 (TGF-3), и 5 нг/мл FGF20 (оба способствуют выживанию прародителей DA). Меняйте среду каждые 2-3 дня. День 21: Создание нервного органоида: семена около 100 нейросфер в условиях воздушно-жидкого интерфейса на мембране PTFE (диаметр 6 мм). Перенесите мембрану в вставку культурной пластины (0,4 мм) и добавьте 1,2 мл среды созревания нейронов, используемой для дифференциации нейросфер, как это было описано ранее. Остановите любое вращение с этого шага. Изменяйте среду каждые 2-3 дня до достижения требуемой временной точки дифференциации.ПРИМЕЧАНИЕ: Что касается нейронного созревания, то наблюдалось снижение нервно-паралитическим маркером Nestin и увеличение зрелых нервных маркеров No3-тубулин и GFAP. Высокие выражения TH и NURR1 наблюдались(Рисунок 3C)и подтверждают нервную органоидную зрелость11. 5. Количественная экспрессия генов TH и Nurr1 для проверки дофаминергической дифференциации Извлечение РНК: В указанный день дифференциации, лис40 нейросфер с 350 зл и буфером RLT (при условии в комплекте экстракции РНК) дополнены 3,5 л 2-меркаптоэтанатола. Извлеките РНК из лисированных нейросфер с помощью комплекта для экстракции РНК, следуя инструкциям производителя. Количественная оценка общей концентрации РНК. Выполните обратную транскрипцию 300 нг от общего объема добычи РНК с использованием обратного комплекта транскрипции для количественной реакции полимеразы в реальном времени (qPCR) и следуйте инструкциям производителя. Выполняйте анализ qPCR на системах обнаружения ПЦР в реальном времени на основе асимметричного обнаружения цианина. Нормализация данных с генами домашнего хозяйства: глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы (GAPDH) и удлинение фактор 1-альфа (EF1). Последовательности грунтовок описаны в таблице 1. 6. Обнаружение жидкой хроматографии высокого давления (HPLC) Используйте жидкой хроматографии высокого давления (HPLC) с электрохимическим обнаружением для обнаружения присутствия дофамина. Допамин был извлечен путем лизании нервных органоидов в 100 мл 0,1 N перхлорной кислоты (HClO4) в течение 15 минут при 4 градусах Цельсия с энергичным вихрем каждые 5 минут. После центрифугации, собирать и хранить супернатант при -20 градусов по Цельсию для дозировки допамина. Используйте столбец C-18 (5 мкм, 4,6 мм х 150 мм), чтобы отделить аналиты по обратной фазе HPLC в изократическом режиме при скорости потока 1 мл/минута. Обнаружение допамина должно осуществляться с помощью кулометрического детектора с кондиционирующей ячейкой, установленной на потенциале в 200 мВ. 7. Необработанная запись данных с помощью платформы микровыборного массива (MEA) Используйте микроскоп для передачи нейросфер в центр пористого устройства MEA. Используйте усилитель и систему сбора данных для электрофизиологических записей. Измерьте соотношение сигнала к шуму (SNR) как стандартное отклонение напряжения во время записи 5 мин, используя сигнал в качестве среднего пикового к пиковому напряжения шипов, зарегистрированных в те же 5 мин.