الأعضاء العصبية البشرية لدراسة سرطان الدماغ والأمراض العصبية
Summary
تقدم هذه الدراسة وتصف بروتوكولات لاشتقاق عضوين عصبيين بشريين محددين كنموذج ذي صلة ودقيق لدراسة 1) تطور الورم الأرومي الدبقي البشري داخل الأعضاء العصبية البشرية حصرافي البشر و 2) الدوبامين العصبية التمايز توليد العضوية ثلاثية الأبعاد.
Abstract
عدم وجود نماذج عصبية ذات صلة في المختبر هو عقبة هامة على التقدم الطبي لاعتلال الأعصاب. إنشاء النماذج الخلوية ذات الصلة أمر بالغ الأهمية على حد سواء لفهم أفضل للآليات المرضية لهذه الأمراض وتحديد الأهداف والاستراتيجيات العلاجية الجديدة. لتكون ذات صلة ، يجب أن النموذج في المختبر إعادة إنتاج السمات المرضية لمرض بشري. ومع ذلك، في سياق الأمراض العصبية، ينبغي أن يوفر نموذج ذي صلة في المختبر استبدال الخلايا العصبية كفرصة علاجية قيمة.
مثل هذا النموذج لن يسمح فقط بفحص الجزيئات العلاجية ولكن أيضا يمكن استخدامها لتحسين التمايز البروتوكول العصبي [على سبيل المثال، في سياق زرع في مرض باركنسون (PD)]. تصف هذه الدراسة اثنين من البروتوكولات في المختبر من 1) تطور الورم الأرومي الدبقي البشري داخل الأعضاء العصبية البشرية (NO) و 2) التوالد الدوبامين العصبية (DA) التمايز توليد ثلاثي الأبعاد (3D) الجهازية. ولهذا الغرض، أُنشئ بروتوكول موحد يسمح بإنتاج المجالات العصبية المعايرة بالحجم المستمدة من تمايز الخلايا الجذعية الجنينية البشرية. يمكن استخدام النموذج الأول للكشف عن الأحداث الجزيئية والخلوية التي تحدث خلال تطور الورم الأرومي الدبقي داخل الجهاز العصبي، في حين أن الجهاز العضوي DA لا يمثل فقط مصدرا مناسبا للخلايا العصبية DA للعلاج الخلوي في مرض باركنسون ولكن أيضا يمكن أن تستخدم لاختبار المخدرات.
Introduction
وتصنف منظمة الصحة العالمية الأورام النجمية على أنها درجة منخفضة (من الدرجة الأولى إلى الثانية) أو درجة عالية (الصفان الثالث والرابع). الورم الأرومي الدبقي المتعدد (GBM) هو ورم أستروسيتوما الصف الرابع، الأكثر فتكا من أورام الدماغ الأولية، التي هي مقاومة لجميع الأشكال الحالية من العلاجات1. على الرغم من معيار الرعاية العلاج بما في ذلك جراحة الأعصاب، والعلاج الكيميائي، والعلاج الإشعاعي، GBM لا يزال قاتلا ومعدل البقاء على قيد الحياة عموما لمدة 15 شهرا لم يتغير بشكل كبير على مدى السنوات ال 15 الماضية2. ولتحقيق تقدم كبير في فهم مسببات الأمراض في الـ GBM، فإن استخدام النماذج ذات الصلة أمر أساسي. حتى الآن، اعتمدت دراسة GBM على خطوط الخلايا، وشرائح القوارض organotypic، وزرع xenotransplant من الخلايا المشتقة من المريض في الفئران أو الفئران المعدلة وراثيا تطوير الأورام العفوية3،4. على الرغم من أن هذه النماذج كانت مفيدة لدراسة ورم الدماغ والعدوانية الورم، فهي مقيدة بالاختلافات بين الأنواع، والاستنتاجات الناتجة قد تترجم بشكل غير صحيح إلى الأنسجة البشرية. وعلاوة على ذلك، فإن النماذج القائمة مع الخلايا البشرية محدودة أيضا بسبب عدم وجود الأنسجة المضيفة / التفاعلات الورم3،4. النماذج التجريبية حاسمة للترجمة من العلوم الأساسية إلى الأهداف العلاجية. ولذلك، فإن وصف بروتوكول لإنتاج الأعضاء العصبية البشرية في المختبر التي تشترك في استزراعها مع الخلايا التي تبدأ GBM (GICs) يمكن أن توفر نظام ًا ذي صلة يحاكي السمات المورفولوجية والوظيفية لتطوير GBM. هذا النظام يستنسخ بعض في ملامح الجسم الحي من تطوير GBMمثل الهجرة المنتشرة من الخلايا الغازية ومناطق نخر، ويسلط الضوء على التعبير الجيني ذات الصلة بيولوجيا الورم. كما تم الكشف سابقا، يتم حث بعض microRNAs الحرجة خلال تطوير مؤسسة الخليج للاستثمار داخل الأنسجة العصبية 3D5،6.
PD هو اضطراب عصبي كبير ويرتبط مع انحطاط الأنواع الفرعية العصبية المتعددة7. حتى لو كان ظهور التدريجي للأعراض (على سبيل المثال، براديكينيسيا، الهزة الراحة غير المتماثلة، وصلابة وعدم استقرار الموقف) يميز المرض، لم يتم تحديد مسبباته بالضبط بوضوح. وفي الواقع، أبرزت العديد من الدراسات أدلة على أن عوامل الخطر الرئيسية يمكن أن تنجم عن مجموعة من العوامل الوراثية والبيئية. ترتبط أعراض باركنسون مع الانحطاط الثنائي للخلايا العصبية الدوبامين في نيغرا substancia (SN)، مما يؤدي إلى اختفاء الدوبامين (DA) محاور إسقاط إلى striatum8،9. ولذلك, ويرتبط الحد من مستويات الدوبامين striatal مع تطور الخلل الحركي في مرضى PD. الخلايا العصبية الدوبامين تحتوي على هيدروكسيلاز التيروزين (TH), إنزيم رئيسي في تركيب الناقلات العصبية الكاتيكولامين التحسسية التي تحول الأحماض الأمينية L-التيروزين إلى L-3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA, الدوبامين السلائف) إلى الدوبامين10. فقدان مبكر من النشاط TH تليها انخفاض في التعبير البروتين TH هو السمة المميزة للPD.
تصف هذه الدراسة بروتوكولين باستخدام الأعضاء العصبية البشرية، مع واحد موجهة على وجه التحديد نحو النمط الظاهري مثل الدماغ المتوسط المخصب مع الخلايا الإيجابية TH.
Protocol
Representative Results
Discussion
ومن أهم جوانب هذا البروتوكول الحفاظ على تعدد القوى في مجال hESC أثناء زراعة الخلايا والرصد الدقيق للمجالات ومورفولوجيا الأعضاء العصبية. hESCs حساسة جدا، وكل تلاعب يمكن أن يؤدي إلى التمايز في وقت مبكر غير المنضبط، فضلا عن موت الخلايا. من أجل زيادة التكرار التجريبي وتجنب حدوث أحداث النمط الكاريوتايب غير الطبيعي، ينصح بالاحتفاظ بالتبريد عدة دفعات من hESCs في الممر الأدنى بعد التحقق من استقرار كروموسومها. وعلاوة على ذلك، فمن المستحسن لإذابة قارورة جديدة لكل تجربة والتحقق من سلوك الخلايا كل يوم. إذا كانت المجالات أقل انكسارمع حجم أعلى غير طبيعي، فإنها من المرجح أن تبدأ في التجميع والموت.
أحد التحسينات على هذا النظام هو إما التسريب أو تنفيذ نظام الأوعية الدموية (عن طريق إضافة الخلايا البطانية أو داخل رقاقة سيولة 3D)12،13. ومع ذلك، فإن التحكم في سمك الجهاز العصبي (≤ 300 ميكرومتر) يسمح بضخ الأكسجين والتغذية السلبي بكفاءة ويمنع النخر. تحسين آخر هو إدخال الخلايا المناعية (microglia). ومع أخذ هذه القيود في الاعتبار، قد تكون الأعضاء العصبية بالإضافة إلى نظام مؤسسة الخليج للاستثمار أداة ذات صلة لعدة أسباب. أولا، يسمح هذا النظام فحص المخدرات لرصد كيف يمكن أن يؤثر مركب علاجي على خلية الجهازية أو الورم. ثانياً، يمكن دراسة التفاعلات بين الخلايا، ويمكن تصور المحددات البيئية الدقيقة الكامنة وراء الغزوات الفردية والجماعية واستكشافها5و6و13.
في سياق مرض باركنسون، يمكن أن يمثل الجهاز العصبي المخصب في الخلايا العصبية DA نموذج 3D ذات الصلة ودقيقة لدراسة تطور المرض. في دراسات سابقة، تم استخدام الخلايا الجذعية متعددة القوى المستحثة من مرض باركنسون والمستمدة من المرضى والمتمايزة تجاه الخلايا العصبية في DA لدراسة الأنواع الفرعية للخلايا العصبية المتأثرة. وتجدر الإشارة إلى أن بعض الأنماط الظاهرية المرتبطة بالأمراض مثل تراكم α-synuclein والحساسية للإجهاد التأكسدي قد لوحظت14،15. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام الجهاز العصبي كأداة لفحص الجزيئات العلاجية. ومع ذلك, ينبغي إعداد التلاوة محددة وذات الصلة لتقييم بقاء الخلايا العصبية DA والوظائف, مثل إنتاج الدوبامين والنشاط الكهربائي الفسيولوجي. وإجمالاً، يوفر هذا البروتوكول نهجين موحدين ودقيقين قائمين على الخلايا الجذعية لتوليد الأعضاء العصبية.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويشكر المؤلفون منظمة “لا ليج جينيفيواز لمكافحة السرطان” (جنيف، سويسرا)، ومؤسسة ISREC (لوزان، سويسرا)، ومؤسسة كلايتون للبحوث (هيوستن، تكساس، الولايات المتحدة الأمريكية) على الدعم المالي. وعلاوة على ذلك، يشكر المؤلفان HES-HO ومركز Wyss على الدعم المالي. نشكر مختبر كراوس على المناقشات المفيدة والدعم والدكتورة هالة قطيش على التدقيق.
Materials
| 6-well plate (6-well plate) | Falcon / Corning | 07-201-588 | |
| ABI Prism 7900 HT detection system (Real-Time PCR detection systems) | Applied Biosystems | Discontinued | |
| Aggrewell 400 (Microwell culture plates ) | StemCell Technologies | 34421 | |
| Amplifier (W2100-HS32) (Amplifier) | Multi Channel Systems | ||
| Anti-EGFR (phospho Y1101) antibody | Abcam | ab76195 | 1/100 dilution |
| Anti-GFAP Antibody | Dako | Z334 | 1/1000 dilution |
| Anti-Nestin, Human Antibody | Millipore | ABD69 | 1/400 dilution |
| Anti-Synapsin I Antibody | Chemicon | AB1543P | 1/500 dilution |
| B27 supplements (B27) | Life Technologies / Invitrogen | 1238 | For both protocol, stock solution 100x, final solution 1x |
| Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) | Cell Guidance | GFH1-2 | For both protocol, stock solution 100 µg/mL in pure H2O, final solution 20 ng/mL |
| CHIR-99021 (GSK-3β inhibitor ) | Axon Medchem | ct99021 | For Dopaminergic protocol, stock solution 7.5 mM in DMSO, final solution 3 µM |
| Compound E a γ–secretase inhibitor (γ–secretase inhibitor) | Calbiochem | CAS 209986-17-4 | For both protocol (gamma-secretase inhibitor XXI), stock solution 5 mM in DMSO, final solution 1 µM |
| Coulochem III (Coulometric detector parameters) | Thermo scientific | ||
| Dibutyryl cyclic-AMP (Dibutyryl cAMP) | Sigma | D0627 | For Dopaminergic protocol, stock solution 0.5 M in DMSO, final solution 0.5 mM |
| Dimethyl Sulfoxide Pure (DMSO) | Sigma-Aldrich | C6164 | Compounds solvent, ready to use |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 12491-015 | For cell culture, ready to use |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium Mixture F-12 (DMEM-F12) | Gibco | 11320033 | For cell culture, ready to use |
| EDTA 0.1 mM (EDTA) | Life Technologies | AM9912 | For cell culture, ready to use |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | Gibco | PHG0313 | For GIC culture, stock solution 100 µg/mL in pure H2O, final solution 10 ng/mL |
| Fibroblast Growth Factor 20 (FGF20) | Peprotech | 100-41 | For Dopaminergic protocol, stock solution 100 µg/mL in pure H2O, final solution 5 ng/mL |
| fibroblast growth factor 8 (FGF8) | Peprotech | GFH176-5 | For Dopaminergic protocol, stock solution 100 µg/mL in pure H2O, final solution 100 ng/mL |
| Fibroblast growth factor-basic (bFGF) | Gibco | PHG0024 | For GIC culture, stock solution 100 µg/mL in pure H2O, final solution 10 ng/mL |
| G5 supplements (G5) | Invitrogen | 17503012 | For GIC culture, stock solution 100x, final solution 1x |
| Glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF) | Cell Guidance | GFH2-2 | For both protocol, stock solution 100 µg/mL in pure H2O, final solution 20 ng/mL |
| Hydrophilic polytetrafluoroethylene membrane (PTFE membrane) | BioCell-Interface | Discontinued | |
| LDN-193189 (BMP inhibitor) | Axon Medchem /Stemgen | 04-0072-02 /1509 | Dual/Smad, stock solution 5 mM in DMSO, final solution 0.5 µM |
| L-glutamine (L-glutamine) | Gibco | 25030081 | L-Glutamine (200 mM), stock solution 200 mM, final solution 2 mM |
| Matrigel (extracellular matrix) | BD Biosciences | 354277 | hESC-qualified Matrix, stock solution 18-22 mg/mL, final solution 180-220 µg/mL |
| Millicell-CM Culture plate insert (0.4 µm) (Culture plate insert) | Millipore | PICM03050 | |
| Monoclonal Anti-β-Tubulin III antibody | Sigma | T8660 | 1/1000 dilution |
| MS Orbital Shaker, MS-NOR-30 (Orbital shaker) | Major Science | MS-NRC-30 | |
| N2 supplements (N2) | Invitrogen | 17502-048 | For GIC culture, stock solution 100x, final solution 1x |
| Nanodrop (Nanodrop) | Thermo Fisher Scientific | Discontinued | |
| Neurobasal (Neurobasal) | Life Technologies / Gibco | 21103049 | Maintenance and maturation embryonic neuronal cell populations , ready to use |
| Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Gibco | 11140 | Non-essential Amino Acids 100X, stock solution 100x, final solution 1x |
| Nurr1 Antibody (M-196) | Santa Cruz | Sc-5568 | 1/100 dilution |
| Nutristem (hESC medium ) | Biological Industries | 05-100-1A | Stem cell media, ready to use |
| Penicilin / Streptomycin (Penicilin / Streptomycin ) | Life Technologies / Gibco | 15140122 | For cell culture, stock solution 5 mg/mL, final solution 50 µg/mL |
| Perchloric acid 0.1N (HCLO4) | Merck | 100519 | For HPLC, ready to use |
| Phosphate Buffered Saline without Ca2+/Mg2+ (PBS without Ca2+/Mg2+ ) | Life Technologies | 14190250 | For cell culture, ready to use |
| PrimeScript RT-PCR Kit (Reverse transcription kit) | Takara | RR014A | |
| Purmorphamin (smoothened agonist) | Calbiochem | SML0868 | For Dopaminergic protocol, stock solution 10 mM in DMSO, final solution 2 µM |
| Rho-associated Kinase Y-27632 (ROCK) | Abcam Biochemicals | ab120129-1 | Rock Inhibitor, stock solution 50 mM in DMSO, final solution 10 µM |
| RNeasy mini kit (RNA extraction kit ) | Qiagen | 74104 | |
| SB-431542 (TGFβ/Activin/Nodal inhibitor ) | Ascent | Asc- 163 | Dual-Smad, stock solution 50 mM in DMSO, final solution 10 µM |
| Sonic Hedgehog (SHH) | Cell Guidance | GFH168-5 | For Dopaminergic protocol, stock solution 100 µg/mL in pure H2O, final solution 100 ng/mL |
| StemPro Accutase (hESC enzymatic solution) | Gibco | A11105-01 | hESC enzymatic solution, ready to use |
| Symmetry C-18,5 mm (4.6 150mm2) (Reversed-phase column) | Waters Corporation | ||
| T150 flask (T150 flask) | Falcon | 08-772-1F | |
| TH Antibody (F-11) | Santa Cruz | Sc-25269 | 1/200 dilution |
| Transforming Growth Factors beta 3 (TGFβ3) | Cell Guidance | GFH109-2 | For Dopaminergic protocol, stock solution 100 µg/mL in pure ethanol , final solution 1 ng/mL |
| Trichostatine A (inhibitor of histone deacetylase ) | Sigma | T8552 | For Dopaminergic protocol, stock solution 100 µM in DMSO, final solution 20 nM |
| TrypLE (recombinant enzymatic solution) | Invitrogen | 12604021 | recombinant enzymatic solution, ready to use |
| Trypsin 0.25% (enzymatic solution) | Life Technologies | 15050065 | enzymatic solution, ready to use |
| W2100, Multi Channel Systems (Data acquisition system ) | WAT045905 | ||
| X-vivo (serum free medium) | Lonza | BE04-743Q | serum free medium, ready to use |
References
- Louis, D. N., et al. The 2016 World Health Organization Classification of Tumors of the Central Nervous System: a summary. Acta Neuropathologica. 131 (6), 803-820 (2016).
- Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. New England Journal of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).
- Daphu, I., et al. In vivo animal models for studying brain metastasis: value and limitations. Clinical and Experimental Metastasis. 30 (5), 695-710 (2013).
- Huszthy, P. C., et al. In vivo models of primary brain tumors: pitfalls and perspectives. Neuro Oncology. 14 (8), 979-993 (2012).
- Nayernia, Z., et al. The relationship between brain tumor cell invasion of engineered neural tissues and in vivo features of glioblastoma. Biomaterials. 34 (33), 8279-8290 (2013).
- Cosset, E., et al. Human tissue engineering allows the identification of active miRNA regulators of glioblastoma aggressiveness. Biomaterials. 107, 74-87 (2016).
- Pringsheim, T., Jette, N., Frolkis, A., Steeves, T. D. The prevalence of Parkinson’s’s disease: a systematic review and meta-analysis. Movement Disorders. 29 (13), 1583-1590 (2014).
- Rajput, A. H., et al. Globus pallidus dopamine and Parkinson’s motor subtypes: clinical and brain biochemical correlation. Neurology. 70 (16 Pt 2), 1403-1410 (2008).
- Jellinger, K. A. Pathology of Parkinson’s’s disease. Changes other than the nigrostriatal pathway. Molecular and Chemical Neuropathology. 14 (3), 153-197 (1991).
- Bernheimer, H., Birkmayer, W., Hornykiewicz, O., Jellinger, K., Seitelberger, F. Brain dopamine and the syndromes of Parkinson’s and Huntington. Clinical, morphological and neurochemical correlations. Journal of Neurological Science. 20 (4), 415-455 (1973).
- Tieng, V., et al. Engineering of midbrain organoids containing long-lived dopaminergic neurons. Stem Cells and Development. 23 (13), 1535-1547 (2014).
- Chen, C. S. 3D Biomimetic Cultures: The Next Platform for Cell Biology. Trends in Cell Biology. 26 (11), 798-800 (2016).
- Friedl, P., Sahai, E., Weiss, S., Yamada, K. M. New dimensions in cell migration. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (11), 743-747 (2012).
- Byers, B., et al. SNCA triplication Parkinson’s’s patient’s iPSC-derived DA neurons accumulate alpha-synuclein and are susceptible to oxidative stress. PLoS ONE. 6 (11), e26159 (2011).
- Flierl, A., et al. Higher vulnerability and stress sensitivity of neuronal precursor cells carrying an alpha-synuclein gene triplication. PLoS ONE. 9 (11), e112413 (2014).
