Inducible, expressão de tipo específico de célula em Arabidopsis thaliana mediada através de LhGR Trans-ativação

Uma grande limitação em biologia na era postgenomic é para decifrar o papel específico do contexto de um determinado fator ou perturbação genética. Perturbações genéticas constitutivas como abordagens da função de perda e ganho-de-função muitas vezes só permitem a análise de ponto de extremidade de processos de adaptação ao longo da vida, ofuscando a distinção entre efeitos primários e secundários. Além disso, funções específicas do contexto podem ser mascaradas ou diluídas por efeitos de grande escala em tecidos distantes ou durante as outras fases do desenvolvimento. Além disso, em casos extremos, a letalidade pode exclui qualquer visão mecanicista. Idealmente, para contornar esses problemas, pode-se analisar o efeito aguda perturbação genética dentro de um contexto específico, como um tipo específico de célula de forma tempo-resolvido. Para conseguir isso, ferramentas genéticas para expressão de tipo específico de célula inducible, são necessários¹. Para fornecer um recurso para a rápida avaliação da dinâmica de uma resposta a uma determinado efetoras spatiotemporal, combinamos a facilidade de clonagem fornecidos pelo sistema GreenGate² com a eficácia comprovada do sistema a GR-LhG4,^{3, 4,5,6}. Podemos ter gerado um conjunto de linhas que expressam o fator de transcrição quimérico que lhg4 fundido para o domínio de ligação do ligante do receptor (GR) corticoide rato⁷ sob o controle de célula bem caracterizadas de promotores específicos tipo⁸. Em condições de repouso, o fator de transcrição permanece fora do núcleo, como o domínio GR é ligado pelo HSP90 citosólica. Com a adição de dexametasona ligante sintético (Dex), translocação nuclear é induzida e LhG4 vai mediar a transcrição das fitas de expressão sob controle de um promotor de cognato sintético pOp-tipo , tais como um repórter mTurquoise2 incluídas nas linhas de motorista Visualizar o domínio de expressão após a indução.  Assim, as linhas de motorista tecnicamente também contêm uma gaveta effector. O cruzamento de um conjunto de linhas de motorista com uma linha carregando uma gaveta effector com, por exemplo, um gene de interesse sob o controle do promotor pOp-tipo mesmo assim, permite a avaliação rápida das consequências agudas ou a longo prazo da expressão effector em uma ampla gama de tipos de células.

Aqui, nós fornecemos um protocolo descrevendo os procedimentos necessários para gerar as linhas de driver e efetoras e demonstrar como expressão específica do tipo celular pode ser induzida e seguido no meristema apical de fotos, a meristema apical de raiz e o cambium da Arabidopsis. Para ilustrar a valentia e a especificidade desta abordagem, nós utilizamos o fator de transcrição conhecidos VND7 que é capaz de conduzir o engrossamento em espiral do tipo xilema secundário celular parede ectopically⁹. Tratamento de F1 de um cruzamento entre o Carbono2grl3vuoluk^10,11 motorista e a pOp6:VND7 effector linha leva à formação de células de xilema, como gravidez ectópica na bainha de amido células da Arabidopsis da haste.

Para facilitar a geração de grandes conjuntos de DNA necessária para a construção de plasmídeos de expressão driver e efetoras, usamos o rápido e eficiente GreenGate clonagem método². GreenGate clonagem é baseado no tipo II S, enzimas de restrição como Eco31I ou sua isoschizomer BsaI². Estas enzimas cortar a jusante de seus sites de reconhecimento assimétrica produzindo saliências com variando a composição de base. Incorporando o Eco31I /Bsaeu restrição sites em oligonucleotides e alocando sequências específicas saliência para elementos de DNA, clonagem modular é alcançado, facilitando a geração de grandes módulos (assemblies). No quadro GreenGate, módulos de DNA se enquadram em categorias A-F com base na sequência de saliência que servem como adaptadores e são montadas nessa ordem. Portanto, as primeiras demão projetadas para amplificar seu produto desejado devem estar de acordo com o módulo selecionado² (figura 1A). Se há um interno Eco31I /Bsaeu site e a sequência não é compatível com os módulos de entrada e destino GreenGate, você pode prosseguir sem mutagenizing, mas com menor eficiência. Como alternativa, use o mutagenesis local-dirigido para remover Eco31I /Bsaeu locais de restrição, tomando cuidado para não alterar os aminoácidos em produtos de genes.