Afleidbare, cel Type-specifieke uiting in Arabidopsis thaliana via LhGR-gemedieerde Trans-activering

Een belangrijke beperking in de biologie in het postgenomic tijdperk is te ontcijferen van de specifieke rol van de context van een gegeven factor of genetische perturbation. Constitutieve genetische verstoringen zoals verlies-van- en winst-van-functie benaderingen vaak alleen toestaan eindpunt analyse van levenslang aanpassing processen, het onderscheid tussen primaire en secundaire effecten obfuscating. Daarnaast kunnen specifieke functies van de context worden gemaskeerd of verdund door grootschalige effecten in verre weefsels of tijdens de andere fasen van ontwikkeling. Bovendien, in extreme gevallen, kan letaliteit beletsel voor ieder mechanistische inzicht. Ideaal, om deze kwesties te omzeilen, kan een analyseren het effect van acute genetische perturbation binnen een specifieke context, zoals een specifieke celtype in een time-resolved wijze. Om dit te bereiken, zijn genetische hulpmiddelen voor afleidbare, cel type-specifieke expressie vereist¹. Om een bron voor de snelle beoordeling van de spatio dynamiek van een reactie op een bepaalde effector, hebben wij gebundeld in het gemak van het klonen van de GreenGate systeem² voorzien van de bewezen doeltreffendheid van de GR-LhG4 systeem^{3, 4,5,6}. We hebben een verzameling lijnen uiten het chimeer transcriptiefactor dat lhg4 tot het ligand bindend domein van de rat corticoid receptor (GR)⁷ onder de controle van goed gekarakteriseerd cel type specifieke initiatiefnemers^{8 gesmolten}gegenereerd. In rust voorwaarden, blijft de transcriptiefactor buiten de kern, zoals het domein GR is gebonden door de cytosolische HSP90. Met de toevoeging van synthetische ligand dexamethason (Dex), nucleaire translocatie wordt geïnduceerd en LhG4 zal bemiddelen transcriptie van expressie cassettes onder controle van de promotor van een cognaat synthetische pOp-type , zoals een mTurquoise2 verslaggever opgenomen in de regels van de bestuurder te visualiseren van het domein van de expressie na inductie.  Dus, de bestuurder regels technisch bevatten ook een effector cassette. Het overschrijden van een verzameling stuurprogramma lijnen met een lijn met een effector cassette met, bijvoorbeeld, een gen van belang onder controle van de promoter pOp-type dezelfde dus laat de snelle beoordeling van de acute of langdurige gevolgen van effector expressie in een groot aantal celtypes.

Hier bieden we een protocol met een beschrijving van de procedures die noodzakelijk zijn voor het genereren van de bestuurder en effector lijnen en aantonen hoe cel type specifieke expressie kan worden geïnduceerd en volgde in het schieten apicale meristeem, de wortel apicale meristeem en de cambium van Arabidopsis. Om te illustreren de dapperheid en de specificiteit van deze aanpak, we gebruik maken van de bekende transcriptiefactor VND7 die in staat van rijden xylem-achtige secundaire cel muur heeft ectopically is⁹. Behandeling van de F1 van een kruising tussen de pSCR^10,11 driver regel en de regel pOp6:VND7 effector leidt tot de vorming van ectopische xylem-achtige cellen in de schede van de zetmeel cellen van de Arabidopsis voortvloeien.

Ter vergemakkelijking van de generatie van grote verzamelingen van DNA nodig voor de bouw van de bestuurder en effector expressie plasmiden, gebruikten we de snelle en efficiënte GreenGate klonen van methode². Het klonen van GreenGate is gebaseerd op de enzymen van de beperking van type II S zoals Eco31I of de isoschizomer Bsaik². Deze enzymen knippen stroomafwaarts van hun sites van de asymmetrische erkenning overhangen met variërende basis samenstelling produceren. Door de integratie van Eco31I /Bsaik beperking sites in oligonucleotides en specifieke overstek sequenties aan DNA-elementen toe te wijzen, modulaire klonen is bereikt, het vergemakkelijken van het genereren van grote verzamelingen. In het kader van GreenGate vallen DNA modules in de categorieën A-F op basis van de volgorde van de overhang die dienen als adapters en worden geassembleerd in die volgorde. Daarom moet de inleidingen aan het versterken van uw gewenste product ontworpen overeenkomstig de geselecteerde module² (figuur 1A). Als er een interne Eco31I is /Bsaik site en de volgorde is niet compatibel met de GreenGate ingang en bestemming modules, kunt u doorgaan zonder mutagenizing, maar met lagere efficiëntie. Als alternatief, plaats-geleide mutagenese kunt verwijderen Eco31I /Bsaik beperkingsplaatsen verzorgen als u niet wilt wijzigen van aminozuren in genproducten.