Индуцибельной, выражение определенного типа клеток в Arabidopsis thaliana через LhGR-опосредованной транс-активация

Одним из основных ограничений в биологии в постгеномную эру является расшифровать конкретную роль контекста данного фактора или генетических возмущений. Учредительного генетических возмущений, таких, как потеря функции и выгоды функция подходы часто только позволяют концевой анализ пожизненный адаптационных процессов, запутывание различие между первичными и вторичными эффектами. Кроме того конкретные функции контекста может быть масках или разбавленный воздействием крупных масштабах в отдаленных тканях или на других этапах развития. Кроме того в крайних случаях, летальность может препятствовать любой механистической проницательность. Идеально чтобы обойти эти проблемы, можно проанализировать эффект острого генетических возмущений в конкретном контексте такие конкретные ячейки типа в духе времени решена. Для достижения этой цели требуется¹генетических средства для индуцибельной, выражение определенного типа клеток. Для обеспечения ресурсов для быстрой оценки динамики пространственно-временных ответа на заданный эффекторных, мы объединили легкость клонирования, представленной GreenGate системе² с доказанной эффективностью системы GR-LhG4^{3, 45,,6}. Мы породили набор линий, выражая химерных транскрипционный фактор, который LhG4 сливается с лигандом связывающий домен крысы корковых рецептор (GR)⁷ под контролем хорошо изученных ячейки типа конкретных промоутеров⁸. В отдыхая условий, транскрипционный фактор остается вне ядра, как GR домена связана цитозольной HSP90. С добавлением синтетических лигандом дексаметазона (Dex) индуцированной ядерных транслокации и LhG4 будет посредничать транскрипции выражение кассет под контролем промотора родственных синтетической поп типа , таких как репортер mTurquoise2 включены в линии драйвер для визуализации выражение домена после индукции.  Таким образом водитель линии технически также содержат эффекторных кассеты. Пересечение набора драйверов линии с линией, перевозящих эффекторных кассету с, например, ген интереса под контролем промотора же поп типа таким образом позволяет быстрой оценки острой или долгосрочных последствий эффекторных выражения в широком диапазоне типов клеток.

Здесь мы предоставляем протокол описания процедур, необходимых для создания линии водителя и эффекторных и продемонстрировать как конкретное выражение типа клеток может быть индуцированных и стрелять апикальной Меристемы, корень апикальной Меристемы и камбий из Арабидопсис. Чтобы проиллюстрировать доблесть и специфичность данного подхода, мы используем известные транскрипционный фактор VND7, который способен вождения утолщений стены клетки ксилемы как средних ectopically⁹. Лечение F1 от помесь pSCR^10,11 драйвер линией и линией эффекторных pOp6:VND7 приводит к образованию внематочная клетки ксилемы как в оболочке крахмала, что стволовые клетки Arabidopsis .

Для облегчения поколения больших сборок ДНК, необходимые для построения драйвера и эффекторных выражение плазмид, мы использовали быстро и эффективно GreenGate, клонирование метод². Клонирование GreenGate основаны на тип II S энзимов ограничения такие как эко31I или его isoschizomer Bsa². Эти ферменты отрезать вниз по течению от их асимметричной признание сайтов производства свесы с различной базовый состав. Включив эко31I /Bsaя ограничения сайтов в олигонуклеотиды и выделения конкретных навеса последовательностей ДНК элементы, Модульная клонирования достигается, содействие поколения больших сборок. В рамках GreenGate ДНК модули делятся на категории, A-F на основе последовательности навеса, которые служат адаптеры и собраны в этом порядке. Таким образом грунты, предназначенные для того чтобы усилить ваш желаемый продукт должен соответствовать выбранный модуль² (рис. 1A). Если есть внутренней эко31I /Bsaя сайта и последовательность не совместим с модулями записи и назначения GreenGate, вы можете продолжить без mutagenizing, но с более низкой эффективности. Кроме того, для удаления эко31I использовать сайт Направленный мутагенез /Bsaя места ограничения, стараясь не изменять аминокислот в продуктах ген.