Inducible, תאים ייחודיים לסוג ביטוי תודרנית לבנה בתיווך דרך LhGR טרנס-הפעלה

מגבלה משמעותית בביולוגיה בעידן postgenomic הוא לפענח את התפקיד בהקשר ספציפי של גורם מסוים או ההפרעות גנטיות. מכוננת לפליטת גנטיות כגון אובדן-של-פונקציה ופונקציה רווח-של גישות אפשר לעתים קרובות רק מובילים ניתוח של תהליכי הסתגלות חיים ארוך, טשטוש ההבחנה בין אפקטים ראשיים ומשניים. בנוסף, פונקציות ספציפיות בהקשר יכול להיות רעולי פנים או מדולל על ידי תופעות בקנה מידה גדול ברקמות מרוחק או במהלך בשלבים אחרים של פיתוח. יתר על כן, במקרים קיצוניים, lethality יכול למנוע כל תובנה מכניסטית. באופן אידיאלי, כדי לעקוף בעיות אלה, אחד יכול לנתח את השפעת ההפרעות גנטיות חריפה בתוך הקשר מסוים כגון סוג תא מסוים באופן זמן לפתור. כדי להשיג זאת, כלים גנטיים לביטוי ייחודיים לסוג התא inducible, הם נדרשים¹. כדי לספק משאב להערכה מהירה של תגובה אפקטור נתון הדינמיקות ייתכן, שילבנו להקל על שיבוט שמספק את מערכת GreenGate² עם יעילות מוכחת של מערכת GR-LhG4^{3, 45,,6}. יש לנו שנוצר קווים לבטא את הפקטור שעתוק chimeric ש-lhg4 התמזגו איגוד ליגנד לתחום של עכברוש corticoid קולטן (גר)⁷ תחת השליטה של התא מאופיין היטב סוג ספציפי היזמים⁸. ב נח תנאים, הגורם שעתוק נשאר מחוץ לגרעין, כמו התחום GR נמדד על ידי HSP90 cytosolic. עם התוספת של דקסאמתאזון ליגנד סינתטי (דקס), רוברטסונית גרעיני מושרה ולסיים LhG4 תמלול קלטות ביטוי תחת שליטה של מקדם cognate סינתטי מסוג pOp , כגון כתב mTurquoise2 כולל הקווים הנהג כדי להמחיש את התחום ביטוי לאחר אינדוקציה.  לפיכך, הקווים הנהג טכנית מכילים גם של קלטת אפקטור. המעבר של הנהג קווים עם שורת נושא של קסטה אפקטור עם, למשל, גן עניין תחת שליטה של האמרגן מסוג pOp אותו ובכך מאפשר את ההערכה המהירה ההשלכות חריפה או לטווח ארוך של הביטוי אפקטור במגוון רחב של סוגי תאים.

כאן, אנו מספקים פרוטוקול המתאר את ההליכים הדרושים כדי ליצור את השורות הנהג ואפקטור ומדגימים איך ביטוי ספציפי של סוג התא יכול להיות המושרה ועקבתי meristem apical את הצילומים, meristem apical את השורש, את cambium של תודרנית. כדי להמחיש את המיומנות וספציפיות של גישה זו, אנו מנצלים את הגורם תמלול ידועה VND7 המסוגל נהיגה thickenings קיר דמוי עצה משנית תא ectopically⁹. בטיפול F1 מן הכלאה בין את pSCR^10,11 הנהג ובין pOp6:VND7 אפקטור הקו שמוביל היווצרות של תאים כמו עצה חוץ רחמי נדן עמילן בתאים של תודרנית גזע.

כדי להקל על הדור של מכלולים דנ א גדולים הנדרשים לבניית פלסמידים ביטוי אפקטור ונהג, השתמשנו GreenGate מהירה ויעילה שיבוט שיטה². שיבוט של GreenGate בהתבסס על סוג II S אנזימי הגבלה כגון לסביבה31I או isoschizomer שלו, Bsaאני². אנזימים אלה לחתוך במורד הזרם של אתרי זיהוי אסימטרי שלהם בהפקת המסוכך עם משתנה הרכב הבסיס. על ידי שילוב לסביבה31I /Bsaאני הגבלת אתרי oligonucleotides, הקצאת רצפי הסככה ספציפי לרכיבי ה-DNA, שיבוט מודולרי מושגת, להקל על הדור של מכלולים גדולים. במסגרת GreenGate, מודולי ה-DNA נחלקים קטגוריות ש-a-F המבוססת על רצף הסככה לשמש מתאמי, הם התאספו לפי הסדר הזה. לכן, צבעי יסוד שנועד להגביר את המוצר הרצוי צריך להיות בהתאם המודול שנבחר² (איור 1 א’). אם יש פנימיים לסביבה31I /Bsaאני באתר ואת הרצף אינה תואמת מודולי כניסה והיעד של GreenGate, תמשיך ללא mutagenizing, אבל עם יעילות נמוכה יותר. לחלופין, השתמש מוטגנזה להסרת לסביבה31I /Bsaאני אתרי הגבלת מטפל לא לשינוי חומצות אמינו במוצרים ג’ין.