Viscoelastica, espressione di tipo specifico delle cellule in Arabidopsis thaliana attraverso LhGR-mediata Trans-attivazione

Una limitazione importante nella biologia, nell’era della postegnomica è quello di decifrare il ruolo specifico del contesto di un determinato fattore o perturbazione genetica. Genetici costitutivi perturbazioni come approcci di funzione di perdita e guadagno di funzione permettono spesso solo endpoint analisi di processi di adattamento permanente, offuscando la distinzione tra effetti primari e secondari. Inoltre, funzioni specifiche di contesto possono essere mascherate o diluite dagli effetti su larga scala nei tessuti distanti o durante altre fasi di sviluppo. Inoltre, in casi estremi, letalità può precludere qualsiasi visione meccanicistica. Idealmente, per ovviare a questi problemi, si potrebbe analizzare l’effetto di perturbazione acuta genetica all’interno di un contesto specifico come uno specifico tipo cellulare in un modo risolta nel tempo. Per raggiungere questo obiettivo, strumenti genetici per inducibile, espressione di tipo specifico delle cellule sono necessarie¹. Per fornire una risorsa per la rapida valutazione spazio-temporale della dinamica di una risposta a un determinato effettore, abbiamo combinato la facilità della clonazione fornito da GreenGate system² con la provata efficacia del GR-LhG4 system^{3, 4,5,6}. Abbiamo generato una serie di linee che esprimono il fattore di trascrizione chimerica che lhg4 fusa per il dominio di legame del ligando del ratto del corticoide del ricevitore (GR)⁷ sotto il controllo di ben caratterizzati cella tipo promotori specifici⁸. In condizioni di riposo, il fattore di trascrizione rimane di fuori del nucleo, come il dominio GR è vincolato il HSP90 citosolico. Con l’aggiunta di ligando sintetico desametasone (Dex), traslocazione nucleare è indotta e LhG4 medierà trascrizione delle cassette di espressione sotto il controllo di un promotore sintetico cognate pOp-tipo , come un reporter di mTurquoise2 tra le linee di driver per visualizzare il dominio di espressione dopo induzione.  Così, le linee di driver tecnicamente inoltre contengono una cassetta dell’effettore. L’attraversamento di un insieme di driver linee con una linea che trasportano una cassetta effettrici con, ad esempio, un gene di interesse sotto il controllo dello stesso tipo di pOp promotore così permette la rapida valutazione delle conseguenze acute o a lungo termine dell’espressione dell’effettore in una vasta gamma di tipi di cellule.

Qui, forniamo un protocollo che descrive le procedure necessarie per generare le linee pilota ed effettrici e dimostrare come espressione specifica del tipo di cella può essere indotta e seguita nel meristema apicale sparare, radice meristema apicale e il cambio di Arabidopsis. Per illustrare la bravura e la specificità di questo approccio, utilizziamo il fattore di trascrizione ben noto VND7 che è in grado di pilotare ectopically cella secondaria xilema-come agenti d’ispessimento parete⁹. Trattamento di F1 da un incrocio tra la riga di driver pSCR^{11 10,}e la linea di effettori pOp6:VND7 conduce alla formazione ectopica xilema-come delle cellule nel fodero dell’amido staminali cellule di Arabidopsis .

Per facilitare la generazione di grandi assiemi di DNA richiesto per la costruzione di driver ed effettrici plasmidi di espressione, abbiamo usato il veloce ed efficiente GreenGate clonazione metodo². Clonazione di GreenGate è basato sugli enzimi di limitazione di tipo II S come Eco31I o sua isoschizomer Bsami². Questi enzimi tagliato a valle dei rispettivi siti di riconoscimento asimmetrica producendo strapiombi con varia composizione base. Incorporando Eco31I /Bsaho siti di restrizione nell’oligonucleotidi e allocare sbalzo specifiche sequenze di elementi del DNA, clonazione modulare è raggiunto, facilitare la generazione di grandi assiemi. Nel quadro GreenGate, moduli di DNA si dividono in categorie A-F basato sulla sequenza di sporgenza che fungono da adattatori e vengono assemblate in quell’ordine. Pertanto, il primer disegnati per amplificare il vostro prodotto desiderato dovrebbe essere secondo il modulo selezionato² (Figura 1A). Se c’è un interno Eco31I /BsaI sito e la sequenza non è compatibile con i moduli di ingresso e destinazione di GreenGate, si può procedere senza mutagenizing, ma con minore efficienza. In alternativa, utilizzare mutagenesi sito-diretta per rimuovere Eco31I /Bsaho siti di restrizione facendo attenzione a non per cambiare gli amminoacidi in prodotti del gene.