Inducibles, expresión de específicas del tipo celular en Arabidopsis thaliana mediada a través de LhGR Trans-activación

Una limitación importante en biología en la era postgenómica es descifrar el papel específico del contexto de un determinado factor o perturbación genética. Perturbaciones genéticas constitutivas como los enfoques de la función de pérdida y ganancia de función a menudo sólo permiten el análisis de punto final de los procesos de adaptación permanente, ofuscación de la distinción entre efectos primarios y secundarios. Además, funciones específicas de contexto pueden ser enmascaradas o diluidas por efectos de gran escala en los tejidos distantes o durante otras fases del desarrollo. Por otra parte, en casos extremos, la mortalidad puede impedir cualquier idea mecanicista. Idealmente, para evitar estos problemas, uno podría analizar el efecto de perturbación genética aguda dentro de un contexto específico como un tipo de células específicas de una manera tiempo-resolved. Para lograr esto, herramientas genéticas de expresión inducible, de tipo específico de célula son necesarios¹. Para proporcionar un recurso para la evaluación rápida de la dinámica espacio-temporal de una respuesta a un determinado efector, hemos combinado la facilidad de clonación proporcionados por el sistema de GreenGate² con la eficacia probada de la GR-LhG4 sistema^{3, 4,5,6}. Hemos generado un conjunto de líneas que expresan el factor de transcripción quimérica LhG4 fusionados con el dominio de unión de ligando de la rata por corticoides tópicos del receptor (GR)⁷ bajo el control de la célula bien caracterizado tipo promotores específicos⁸. En condiciones de reposo, el factor de transcripción permanece fuera del núcleo, como el dominio GR está limitado por la HSP90 citosólica. Con la adición de dexametasona (Dex) de ligando sintético, se induce translocación nuclear y LhG4 se median la transcripción de las cassettes de expresión bajo control de un promotor de cognado sintético tipo pOp , como un reportero de mTurquoise2 dentro de las líneas piloto para visualizar el dominio de la expresión después de la inducción.  Así, las líneas de conductor técnico también contienen un casete del efector. El cruce de un conjunto de líneas de conductor con una línea con un casete de efectores con, por ejemplo, un gen de interés bajo el control del mismo tipo de pOp promotor así permite la evaluación rápida de las consecuencias agudas o a largo plazo de la expresión de efector en una amplia gama de tipos celulares.

Presentamos un protocolo que describe los procedimientos necesarios para generar las líneas de controlador y generador de efectos y demostrar cómo expresión específica de tipo celular puede ser inducida y seguida en el meristemo apical de brote, el meristemo apical de raíz y el cambium de Arabidopsis. Para ilustrar la destreza y la especificidad de este enfoque, utilizamos el factor de transcripción conocido VND7 que es capaz de conducir ectopically engrosamientos de pared de célula secundaria de xilema como⁹. Tratamiento de la F1 de un cruce entre la línea de conductor¹¹ pSCR^10,y la línea de efectos de pOp6:VND7 conduce a la formación ectópica xilema-como las células de la vaina de almidón células de Arabidopsis del tallo.

Para facilitar la generación de grandes conjuntos de ADN necesaria para la construcción de plásmidos de expresión controlador y generador de efectos, utilizamos la rápida y eficiente GreenGate clonación método². Clonación de GreenGate es basado en enzimas de restricción tipo II S como Eco31I o su isoschizomer Bsay². Estas enzimas cortan río abajo de sus sitios de reconocimiento asimétrica produciendo proyecciones con diferentes composición de base. Mediante la incorporación de Eco31I /Bsasitios de restricción en oligonucleótidos y asignar secuencias de proyección específica para elementos de ADN, clonación modular se obtiene, facilitando la generación de grandes ensamblajes. En el marco de GreenGate, módulos de ADN se dividen en categorías A-F basado en proyección de la secuencia que sirven como adaptadores y se montan en ese orden. Por lo tanto, los cebadores diseñados para amplificar el producto deseado deben ser según el módulo seleccionado² (figura 1A). Si hay una interna Eco31IBsadel sitio y la secuencia no es compatible con los módulos de entrada y destino de GreenGate, puede continuar sin mutagenizing, pero con menor eficiencia. Como alternativa, utilice mutagénesis sitio-dirigida para quitar Eco31I /Bsasitios de restricción teniendo cuidado de no para cambiar los aminoácidos en los productos del gene.