إيندوسيبلي، الخلية المحددة بنوع التعبير في نبات التمويل "عن طريق لحجر" بوساطة ترانس-التنشيط
Summary
هنا، يصف لنا توليد وتطبيق مجموعة من المعدلة وراثيا التمويل نبات خطوط التعبير إيندوسيبلي، الخاصة بالانسجة مواتية في الخلايا الإنشائية الرئيسية الثلاثة وأرض قمية تبادل لإطلاق النار وأرض قمية الجذر وكامبيوم.
Abstract
التعبير إيندوسيبلي والأنسجة على حدة أداة هامة وقوية لدراسة ديناميات اضطراب الوراثية الزمانية. الجمع بين جرينجاتي بالمرونة والكفاءة الاستنساخ مع نظام ثبت ومرجعية لهجر نظام (يطلق عليها هنا غرام-LhG4) للتعبير إيندوسيبلي، نحن قد ولدت مجموعة من خطوط نبات المعدلة وراثيا التي يمكن أن تدفع بالتعبير عن المستجيب كاسيت بمجموعة من أنواع الخلايا المحددة في الخلايا الإنشائية النباتية الرئيسية الثلاثة. وتحقيقا لهذه الغاية، اخترنا نظام الموارد الوراثية-LhG4 المتقدمة سابقا على أساس عامل نسخ تشيميريك ومروج المشابهة من نوع البوب ضمان رقابة مشددة على مجموعة واسعة من مستويات التعبير. وباﻹضافة إلى ذلك، تصور المجال التعبير التي تنشط فيها عامل النسخ الاصطناعية، يتم ترميز مراسل فلورسنت المترجمة ER mTurquoise2 تحت سيطرة المروج pOp4 أو pOp6 في خطوط برنامج التشغيل. هنا، نحن تصف الخطوات الضرورية لإنشاء سطر برنامج التشغيل أو المستجيب، وتبين كيف يمكن الناجمين عن خلية محددة نوع التعبير وأتباعه في أرض قمية تبادل لإطلاق النار، وأرض قمية الجذر وكامبيوم من نبات. باستخدام برنامج تشغيل عدة أو كافة خطوط، أثر سياق محدد للتعبير عن أحد أو عوامل متعددة (المستجيبة) تحت سيطرة المروج الاصطناعية البوب يمكن تقييم سرعة، على سبيل المثال في مصانع F1 من عبور بين المستجيب واحدة ومتعددة خطوط برنامج التشغيل. ويتجلى هذا النهج التعبير حمل خارج الرحم من VND7، عامل نسخ NAC قادرة على حمل خارج الرحم الثانوية خلية الجدار ترسب بطريقة ذاتية في خلية.
Introduction
قيداً رئيسيا في علم الأحياء في عصر بوستجينوميك فك سياق الدور المحدد لعامل معين أو اضطراب الوراثية. كثيرا ما لا تسمح التأسيسي الاضطرابات الوراثية مثل النهج فقدان للوظيفة والكسب من وظيفة تحليل نقطة النهاية لعمليات التكيف مدى الحياة، تشويش التمييز بين الآثار الأولية والثانوية. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن ملثمين سياق مهام محددة أو يخفف من آثار واسعة النطاق في أنسجة بعيدة أو خلال مراحل أخرى من التنمية. وعلاوة على ذلك، في الحالات القصوى، يمكن أن يحول دون الفتك أي فكرة آليا. ومن الناحية المثالية، للالتفاف حول هذه القضايا، أحد يمكن تحليل أثر اضطراب الوراثية الحادة داخل سياق محدد مثل نوع خلية محددة بطريقة حل الوقت. ولتحقيق ذلك، هي الأدوات الجينية للخلية إيندوسيبلي، الخاصة بنوع التعبير المطلوبة1. لتوفير موارد للتقييم السريع لديناميات الزمانية المكانية استجابة للمستجيب عينها، جمعنا بين سهولة الاستنساخ المنصوص عليها في نظام جرينجاتي2 مع أثبتت فعاليتها من نظام الموارد الوراثية-LhG43، 45،،6. ونحن قد ولدت مجموعة من خطوط التعبير عن عامل النسخ تشيميريك LhG4 تنصهر فيها المجال ملزم يجند من الفئران كورتيكويد مستقبلات (GR)7 تحت سيطرة المروجين محددة نوع الخلية جيدا تتسم8. في استراحة الظروف، يبقى عامل النسخ خارج النواة، كما يرتبط المجال الموارد الوراثية قبل HSP90 سيتوسوليك. مع إضافة يجند الاصطناعية الديكساميتازون (Dex)، هو فعل إزفاء النووية وسوف التوسط LhG4 النسخ من أشرطة الكاسيت التعبير تحت سيطرة المروج الاصطناعية المشابهة من نوع البوب ، مثل مراسل mTurquoise2 وشملت في بنود برنامج التشغيل تصور المجال التعبير بعد التعريفي. وهكذا، الخطوط برنامج تشغيل تقنيا تحتوي أيضا على كاسيت المستجيب. عبور مجموعة من بنود برنامج التشغيل مع خط يحمل كاسيت المستجيب مع، على سبيل المثال، أحد جينات للفائدة تحت التحكم من نفس نوع البوب المروج وهكذا يسمح التقييم السريع لآثار حادة أو طويلة الأجل المستجيب التعبير في مجموعة واسعة من أنواع الخلايا.
هنا، نحن نقدم بروتوكول وصف الإجراءات اللازمة لإنشاء خطوط السائق والمستجيب، وتثبت كيف يمكن الناجم عن خلية محددة نوع التعبير وأتباعه في أرض قمية تبادل لإطلاق النار، وأرض قمية الجذر وكامبيوم من نبات. لتوضيح ذلك ببراعة وخصوصية لهذا النهج، فنحن نستخدم عامل النسخ المعروفة VND7 وقادرة على قيادة الخلية الثانوية مثل الخشب الجدار ثيكينينجس اكتوبيكالي9. علاج F1 من عبور بين السطر برنامج تشغيل11 10، pSCRوخط المستجيب pOp6:VND7 يؤدي إلى تكوين خلايا الخشب مثل حمل خارج الرحم في غمد النشا وقف الخلايا من نبات .
لتيسير توليد التجميعات الحمض النووي الكبيرة اللازمة لتشييد والبلازميدات التعبير السائق والمستجيب، كنا جرينجاتي بسرعة وكفاءة استنساخ الأسلوب2. جرنجيت الاستنساخ أساس في النوع الثاني S تقييد الإنزيمات مثل منظمة التعاون الاقتصادي31I أو إيسوشيزومير في جيش صرب البوسنة2. هذه الإنزيمات قطع المصب من مواقعهم الاعتراف غير المتناظر المنتجة يتدلى مع اختلاف تكوين قاعدة. من خلال دمج الإيكولوجية31I/جيش صرب البوسنةأنا تقييد مواقع في النوكليوتيد وتخصيص تسلسلات عبء محددة لعناصر الحمض النووي، استنساخ وحدات يتحقق، تيسير توليد التجمعات الكبيرة. وفي إطار جرنجيت، وحدات الحمض النووي تنقسم إلى فئات واو استناداً إلى تسلسل المتراكمة التي تعمل كمحولات ويتم تجميعها في هذا النظام. ولذلك، ينبغي أن تكون كبسولة تفجير تهدف إلى تضخيم المنتج المطلوب وفقا للوحدة النمطية المحددة2 (الشكل 1A). إذا كان هناك داخلية الإيكولوجية31I/جيش صرب البوسنةأنا الموقع والتسلسل غير متوافق مع وحدات الإدخال والوجهة جرينجاتي، يمكنك المتابعة دون موتاجينيزينج، ولكن بكفاءة أقل. بدلاً من ذلك، استخدام الطفرات موقع الموجه لإزالة الإيكولوجية31I/جيش صرب البوسنةوأنا تقييد مواقع مع الحرص على عدم تغيير الأحماض الأمينية في منتجات الجينات.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا، نحن تصف الخطوات الضرورية لإنشاء وتطبيق مجموعة أدوات متنوعة وشاملة لنوع الخلية إيندوسيبلي، محددة ترانس-التنشيط. عبور خطوط تحمل أشرطة الكاسيت المستجيب تحت سيطرة المروج البوب مع خطوط برنامج تشغيل يسمح لدراسة آثار سوء التعبير في الجيل F1، تمكين التقييم السريع لاضطراب الوراثية…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
عمل في مختبراتنا معتمد من قبل مؤسسة البحوث الألمانية (DFG) منح WO 1660/6-1 (إلى جنوب غرب) و “الموارد الوراثية” 2104/4-1 (إلى آثاريا) و SFB1101 (إلى آثاريا و J.U.L) ومجلس البحوث الأوروبي منح consolidator (بلانتستيمس 647148) إلى آثاريا جنوب غرب معتمد من خلال “الزمالة إيمي نويثر” من DFG من خلال منحة WO 1660/2.
Materials
| Ampicillin | Carl Roth GmbH + Co. KG | K029.1 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C1919 | |
| Column purification | Qiagen | QIAquick PCR Purification Kit (250) | |
| Culture chamber for imaging | Sarstedt AG & Co. KG | 1-well tissue culture chamber, on cover glass II | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4903 | |
| DMSO | Fisher Scientific, UK | D139-1 | |
| Eco31I | Thermo Fisher Scientific | FD0294 | |
| injection cannula (0.30 x 12 mm, 30 G x 1/2) | Sterican, Braun | ||
| Kanamycin | Carl Roth GmbH + Co. KG | T832.2 | |
| Leica TCS SP5 CLSM, HCX PL APO lambda blue 63x water immersion objectiv | Leica, Wetzlar, Germany | ||
| MS medium | Duchefa, Haarlem, Netherlands | M0221.0050 | |
| Nikon A1 CLSM, Apo LWD 25x 1.1 NA water immersion objective | Nikon, Minato, Tokyo, Japan | ||
| Petri dish 35/10 mm | Greiner Bio-One GmbH, Germany | 627102 | |
| Petri dish 60/150 mm | Greiner Bio-One GmbH, Germany | 628102 | |
| Petri dish 120/120/17 | Greiner Bio-One GmbH, Germany | 688102 | |
| Plant agar | Duchefa, Haarlem, Netherlands | P1001 | |
| Plasmid extraction | Qiagen | QIAprep Spin Miniprep Kit | |
| Propidium iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4170 | |
| Razorblade | Classic, Wilkinson Sword GmbH | 7005115E | |
| Reaction tubes | Sarstedt AG & Co. KG | 72.690.001 | |
| Silwet L-77 | Kurt Obermeier GmbH & Co. KG, Bad Berleburg, Germany | ||
| Spectinomycin | AppliChem GmbH | 3834.001 | |
| Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | NanoDrop 2000c | |
| Sucrose | Carl Roth GmbH + Co. KG | 4621.1 | |
| Sulfadiazine | Sigma-Aldrich | S6387 | |
| Tetracycline | AppliChem GmbH | 2228.0025 | |
| T4 Ligase 5 U/µl | Thermo Fisher Scientific | EL0011 | |
| T4 Ligase 30 U/µl | Thermo Fisher Scientific | EL0013 |
References
- Moore, I., Samalova, M., Kurup, S. Transactivated and chemically inducible gene expression in plants. The Plant Journal. 45 (4), 651-683 (2006).
- Lampropoulos, A., et al. GreenGate—a novel, versatile, and efficient cloning system for plant transgenesis. PLoS One. 8 (12), e83043 (2013).
- Baroux, C., et al. Predictable activation of tissue-specific expression from a single gene locus using the pOp/LhG4 transactivation system in Arabidopsis. Plant Biotechnology Journal. 3 (1), 91-101 (2005).
- Craft, J., et al. New pOp/LhG4 vectors for stringent glucocorticoid-dependent transgene expression in Arabidopsis. The Plant Journal. 41 (6), 899-918 (2005).
- Moore, I., Galweiler, L., Grosskopf, D., Schell, J., Palme, K. A transcription activation system for regulated gene expression in transgenic plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (1), 376-381 (1998).
- Samalova, M., Brzobohaty, B., Moore, I. pOp6/LhGR: a stringently regulated and highly responsive dexamethasone-inducible gene expression system for tobacco. The Plant Journal. 41 (6), 919-935 (2005).
- Picard, D. Steroid-binding domains for regulating the functions of heterologous proteins in cis. Trends in Cell Biology. 3 (8), 278-280 (1993).
- Schurholz, A. K., et al. A Comprehensive Toolkit for Inducible, Cell Type-Specific Gene Expression in Arabidopsis. Plant Physiology. 178 (1), 40-53 (2018).
- Kubo, M., et al. Transcription switches for protoxylem and metaxylem vessel formation. Genes and Development. 19 (16), 1855-1860 (2005).
- Di Laurenzio, L., et al. The SCARECROW gene regulates an asymmetric cell division that is essential for generating the radial organization of the Arabidopsis root. Cell. 86 (3), 423-433 (1996).
- Wysocka-Diller, J. W., Helariutta, Y., Fukaki, H., Malamy, J. E., Benfey, P. N. Molecular analysis of SCARECROW function reveals a radial patterning mechanism common to root and shoot. Development. 127 (3), 595-603 (2000).
- Hellens, R. P., Edwards, E. A., Leyland, N. R., Bean, S., Mullineaux, P. M. pGreen: a versatile and flexible binary Ti vector for Agrobacterium-mediated plant transformation. Plant Molecular Biology. 42 (6), 819-832 (2000).
- Zhang, X., Henriques, R., Lin, S. S., Niu, Q. W., Chua, N. H. Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method. Nature Protocols. 1 (2), 641-646 (2006).
- Kleinboelting, N., Huep, G., Kloetgen, A., Viehoever, P., Weisshaar, B. GABI-Kat SimpleSearch: new features of the Arabidopsis thaliana T-DNA mutant database. Nucleic Acids Research. 40 (Database issue), D1211-D1215 (2012).
- . Selection scheme used at GABI-Kat for resistance to sulfadiazine Available from: https://www.gabi-kat.de/methods/sul-selection-scheme.html (2018)
- Huang, Y., et al. Standard addition quantitative real-time PCR (SAQPCR): a novel approach for determination of transgene copy number avoiding PCR efficiency estimation. PLoS One. 8 (1), e53489 (2013).
- Wallner, E. S., et al. Strigolactone- and Karrikin-Independent SMXL Proteins Are Central Regulators of Phloem Formation. Current Biology. 27 (8), 1241-1247 (2017).
- Fletcher, J. C., Brand, U., Running, M. P., Simon, R., Meyerowitz, E. M. Signaling of cell fate decisions by CLAVATA3 in Arabidopsis shoot meristems. Science. 283 (5409), 1911-1914 (1999).
- Watanabe, Y., et al. Visualization of cellulose synthases in Arabidopsis secondary cell walls. Science. 350 (6257), 198-203 (2015).
- Yamaguchi, M., et al. VASCULAR-RELATED NAC-DOMAIN6 and VASCULAR-RELATED NAC-DOMAIN7 effectively induce transdifferentiation into xylem vessel elements under control of an induction system. Plant Physiology. 153 (3), 906-914 (2010).
- Engineer, C. B., Fitzsimmons, K. C., Schmuke, J. J., Dotson, S. B., Kranz, R. G. Development and evaluation of a Gal4-mediated LUC/GFP/GUS enhancer trap system in Arabidopsis. BMC Plant Biology. 5, 9 (2005).
- Aoyama, T., Chua, N. H. A glucocorticoid-mediated transcriptional induction system in transgenic plants. The Plant Journal. 11 (3), 605-612 (1997).
- Decaestecker, W., et al. CRISPR-TSKO facilitates efficient cell type-, tissue-, or organ-specific mutagenesis in Arabidopsis. bioRxiv. , (2018).
