誘導、細胞型における発現シロイヌナズナLhGR を介したトランス-活性化
Summary
ここでは、我々 は生成を記述して形質転換シロイヌナズナのセットのアプリケーション線 3 主な分裂、茎頂や根の頂端分裂組織形成層で有効にする、組織固有の誘導式です。
Abstract
誘導、組織固有の式は遺伝的摂動の時空間的ダイナミクスを研究するための重要かつ強力なツールです。エフェクターの式をドライブすることができます形質転換シロイヌナズナ行セットを生成しているクローン作成実績とベンチマークを行った LhGR システム (ここでは GR LhG4 と呼ばれる) 誘導式の柔軟かつ効率的な GreenGate 組み合わせることで、3 つの主要な植物の分裂で特定の細胞型の範囲でのカセット。このため、我々 はキメラ転写因子と表現のレベルの広い範囲にわたってタイトなコントロールを確保する同種pOp 型プロモーターに基づいて開発済みの GR LhG4 システムを選んだ。さらに、合成転写因子がアクティブ式ドメインを視覚化するpOp4 または pOp6プロモーターの制御下で ER ローカライズ mTurquoise2 蛍光レポーターはドライバーの行でエンコードされます。ここでは、ドライバーまたはエフェクター ラインを生成し、細胞型特異的発現の誘導および茎頂、根の頂端分裂組織とシロイヌナズナのひこばえに続いてできる方法を示すに必要な手順について述べる。使用するには、いくつかまたはすべてのドライバー ライン、1 つのコンテキスト特定効果かポップ合成プロモーターの制御下で複数の要因 (エフェクター) を 1 つのエフェクターと複数間のクロスの F1 植物で急速に、たとえば評価できます。ドライバーの行。このアプローチは、VND7、細胞自律的に異所性の二次細胞壁形成を誘導することができる NAC 転写因子の異所性発現によって例証されます。
Introduction
ポストゲノム時代における生物学の主要な制限は、特定の要因や遺伝的摂動のコンテキストの特定の役割を解読することです。関数の損失と利得の機能のアプローチなど遺伝的摂動構成では、プライマリとセカンダリの効果の違いを難読化、生涯適応プロセスのエンドポイント解析頻繁のみ許可します。さらに、コンテキストの特定の機能をマスクまたは遠い組織または開発の他の段階で大規模な効果によって希釈できます。また、極端な場合、致死することができます任意の機械論的な洞察力を妨げるもの。理想的には、これらの問題を回避するために、時間分解の方法で特定のセル型などの特定のコンテキスト内で急性の遺伝的摂動の効果を分析 1 つ。そのためには、誘導、細胞型特異的発現の遺伝学的ツール、必要な1です。与えられたエフェクターへの応答の時空間ダイナミクスの迅速な評価のため、リソースを提供するために我々 は定める GreenGate システム2 GR LhG4 システム3,の実証済みの有効性とクローン作成の容易さを結合した4,5,6。我々 は、LhG4 はよく特徴付けられる細胞の種類特定のプロモーター8の制御の下でラットのコルチコイド受容体 (GR)7のリガンド結合ドメインに融合キメラ転写因子を表現する行のセットを生成しています。GR ドメインは細胞質 HSP90 に拘束条件を安静時の転写因子の核外ままです。合成リガンド デキサメタゾン (Dex) の追加により、核移行が誘導される LhG4 は式カセット mTurquoise2 記者などの同種合成pOp 型プロモーターの制御下での転写を仲介して誘導後定義式のドメインを視覚化するドライバーの行に含まれます。 したがって、ドライバーの行技術的にまた含まれているエフェクタ カセット。したがって、たとえば、同じpOp 型プロモーターの制御下で興味の遺伝子とエフェクター カセットを運ぶライン ドライバーの行のセットの交差により、エフェクター表現の急性または長期的な結果を迅速に評価幅広い種類の細胞。
ここで、ドライバーとエフェクターの行を生成し、細胞型特異的発現が誘導し、茎頂や根の頂端分裂組織の形成に続いて方法を示して必要な手順を記述したプロトコルを提供します。シロイヌナズナ。力とこの方法の特異性を説明するためによく知られているトランスクリプション要因 VND7 異所萌出へ木部二次細胞壁肥厚を運転することができる利用9。シロイヌナズナの細胞幹デンプン鞘内異所性木部細胞の形成につながるpSCR10,11ドライバー ラインとpOp6:VND7エフェクター ライン間のクロスから F1 を治療します。
ドライバーとエフェクターの発現プラスミドを構築するために必要な大規模な DNA アセンブリの生成を容易にするには、方法2のクローン作成の迅速かつ効率的な GreenGate を使用しました。GreenGate クローニングは2エコ31I やその isoschizomer Bsaなどタイプ II 制限酵素に基づいています。これらの酵素はカット基本組成を変化させてオーバー ハングを生産、不斉認識サイトの下流。エコ31I を組み込むことによって/Bsa私制限サイト オリゴヌクレオチドと DNA 要素に特定の突出部分シーケンスの割り当て、モジュラー クローン作成を実現、大規模なアセンブリの生成を促進します。GreenGate フレームワークで DNA モジュールはアダプターとして機能し、その順序で組み立てられて A ~ F オーバー ハング シーケンスに基づいてカテゴリに分類されます。したがって、ご希望の商品を増幅するプライマーは選択したモジュール2 (図 1 a) に従ってする必要があります。内部エコ31I/Bsa私はサイトとシーケンスは GreenGate エントリと宛先モジュールと互換性がない、mutagenizing、なく低い効率を進むことが。また、サイト指示された突然変異誘発を使用してエコ31I を削除する/Bsa私遺伝子産物中のアミノ酸を変更するように注意して、制限のサイト。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、生成および誘導型、セル型特定トランスの汎用性と包括的なツールキットを適用に必要な手順を述べる-活性化。ドライバーの行とポップのプロモーターの制御下でエフェクター カセットを運ぶラインを渡る F1 世代、幅広い種類の細胞で遺伝的摂動の迅速な評価を有効にすることで誤表現効果を勉強できます。また、エフェクターの構造は、ドライバーの行に変換す?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々 の研究室での仕事はドイツ研究振興協会 (DFG) によってサポートされている助成金ヲ 1660/6-1 (南西) におよび GR 2104/4-1 (T.G.) と (TG および J.U.L) に SFB1101 と欧州研究評議会によってコンソリ データ付与 (PLANTSTEMS 647148) T.G. 南西は DFG を通じて助成を 1660/2 エミー賞ネーター的な団体を通してサポートされています。
Materials
| Ampicillin | Carl Roth GmbH + Co. KG | K029.1 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C1919 | |
| Column purification | Qiagen | QIAquick PCR Purification Kit (250) | |
| Culture chamber for imaging | Sarstedt AG & Co. KG | 1-well tissue culture chamber, on cover glass II | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4903 | |
| DMSO | Fisher Scientific, UK | D139-1 | |
| Eco31I | Thermo Fisher Scientific | FD0294 | |
| injection cannula (0.30 x 12 mm, 30 G x 1/2) | Sterican, Braun | ||
| Kanamycin | Carl Roth GmbH + Co. KG | T832.2 | |
| Leica TCS SP5 CLSM, HCX PL APO lambda blue 63x water immersion objectiv | Leica, Wetzlar, Germany | ||
| MS medium | Duchefa, Haarlem, Netherlands | M0221.0050 | |
| Nikon A1 CLSM, Apo LWD 25x 1.1 NA water immersion objective | Nikon, Minato, Tokyo, Japan | ||
| Petri dish 35/10 mm | Greiner Bio-One GmbH, Germany | 627102 | |
| Petri dish 60/150 mm | Greiner Bio-One GmbH, Germany | 628102 | |
| Petri dish 120/120/17 | Greiner Bio-One GmbH, Germany | 688102 | |
| Plant agar | Duchefa, Haarlem, Netherlands | P1001 | |
| Plasmid extraction | Qiagen | QIAprep Spin Miniprep Kit | |
| Propidium iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4170 | |
| Razorblade | Classic, Wilkinson Sword GmbH | 7005115E | |
| Reaction tubes | Sarstedt AG & Co. KG | 72.690.001 | |
| Silwet L-77 | Kurt Obermeier GmbH & Co. KG, Bad Berleburg, Germany | ||
| Spectinomycin | AppliChem GmbH | 3834.001 | |
| Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | NanoDrop 2000c | |
| Sucrose | Carl Roth GmbH + Co. KG | 4621.1 | |
| Sulfadiazine | Sigma-Aldrich | S6387 | |
| Tetracycline | AppliChem GmbH | 2228.0025 | |
| T4 Ligase 5 U/µl | Thermo Fisher Scientific | EL0011 | |
| T4 Ligase 30 U/µl | Thermo Fisher Scientific | EL0013 |
References
- Moore, I., Samalova, M., Kurup, S. Transactivated and chemically inducible gene expression in plants. The Plant Journal. 45 (4), 651-683 (2006).
- Lampropoulos, A., et al. GreenGate—a novel, versatile, and efficient cloning system for plant transgenesis. PLoS One. 8 (12), e83043 (2013).
- Baroux, C., et al. Predictable activation of tissue-specific expression from a single gene locus using the pOp/LhG4 transactivation system in Arabidopsis. Plant Biotechnology Journal. 3 (1), 91-101 (2005).
- Craft, J., et al. New pOp/LhG4 vectors for stringent glucocorticoid-dependent transgene expression in Arabidopsis. The Plant Journal. 41 (6), 899-918 (2005).
- Moore, I., Galweiler, L., Grosskopf, D., Schell, J., Palme, K. A transcription activation system for regulated gene expression in transgenic plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (1), 376-381 (1998).
- Samalova, M., Brzobohaty, B., Moore, I. pOp6/LhGR: a stringently regulated and highly responsive dexamethasone-inducible gene expression system for tobacco. The Plant Journal. 41 (6), 919-935 (2005).
- Picard, D. Steroid-binding domains for regulating the functions of heterologous proteins in cis. Trends in Cell Biology. 3 (8), 278-280 (1993).
- Schurholz, A. K., et al. A Comprehensive Toolkit for Inducible, Cell Type-Specific Gene Expression in Arabidopsis. Plant Physiology. 178 (1), 40-53 (2018).
- Kubo, M., et al. Transcription switches for protoxylem and metaxylem vessel formation. Genes and Development. 19 (16), 1855-1860 (2005).
- Di Laurenzio, L., et al. The SCARECROW gene regulates an asymmetric cell division that is essential for generating the radial organization of the Arabidopsis root. Cell. 86 (3), 423-433 (1996).
- Wysocka-Diller, J. W., Helariutta, Y., Fukaki, H., Malamy, J. E., Benfey, P. N. Molecular analysis of SCARECROW function reveals a radial patterning mechanism common to root and shoot. Development. 127 (3), 595-603 (2000).
- Hellens, R. P., Edwards, E. A., Leyland, N. R., Bean, S., Mullineaux, P. M. pGreen: a versatile and flexible binary Ti vector for Agrobacterium-mediated plant transformation. Plant Molecular Biology. 42 (6), 819-832 (2000).
- Zhang, X., Henriques, R., Lin, S. S., Niu, Q. W., Chua, N. H. Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method. Nature Protocols. 1 (2), 641-646 (2006).
- Kleinboelting, N., Huep, G., Kloetgen, A., Viehoever, P., Weisshaar, B. GABI-Kat SimpleSearch: new features of the Arabidopsis thaliana T-DNA mutant database. Nucleic Acids Research. 40 (Database issue), D1211-D1215 (2012).
- . Selection scheme used at GABI-Kat for resistance to sulfadiazine Available from: https://www.gabi-kat.de/methods/sul-selection-scheme.html (2018)
- Huang, Y., et al. Standard addition quantitative real-time PCR (SAQPCR): a novel approach for determination of transgene copy number avoiding PCR efficiency estimation. PLoS One. 8 (1), e53489 (2013).
- Wallner, E. S., et al. Strigolactone- and Karrikin-Independent SMXL Proteins Are Central Regulators of Phloem Formation. Current Biology. 27 (8), 1241-1247 (2017).
- Fletcher, J. C., Brand, U., Running, M. P., Simon, R., Meyerowitz, E. M. Signaling of cell fate decisions by CLAVATA3 in Arabidopsis shoot meristems. Science. 283 (5409), 1911-1914 (1999).
- Watanabe, Y., et al. Visualization of cellulose synthases in Arabidopsis secondary cell walls. Science. 350 (6257), 198-203 (2015).
- Yamaguchi, M., et al. VASCULAR-RELATED NAC-DOMAIN6 and VASCULAR-RELATED NAC-DOMAIN7 effectively induce transdifferentiation into xylem vessel elements under control of an induction system. Plant Physiology. 153 (3), 906-914 (2010).
- Engineer, C. B., Fitzsimmons, K. C., Schmuke, J. J., Dotson, S. B., Kranz, R. G. Development and evaluation of a Gal4-mediated LUC/GFP/GUS enhancer trap system in Arabidopsis. BMC Plant Biology. 5, 9 (2005).
- Aoyama, T., Chua, N. H. A glucocorticoid-mediated transcriptional induction system in transgenic plants. The Plant Journal. 11 (3), 605-612 (1997).
- Decaestecker, W., et al. CRISPR-TSKO facilitates efficient cell type-, tissue-, or organ-specific mutagenesis in Arabidopsis. bioRxiv. , (2018).
