In vivo Calcium Imaging em C. elegans corpo parede músculos

Este papel apresenta métodos para a imagem latente in vivo do cálcio de C. elegans músculos da parede do corpo usando a estimulação neuronal optogenética. Emparelhar um indicador de cálcio geneticamente codificado expresso (GECI) com luz azul desencadeou a despolarização neuronal e fornece um sistema para observar claramente os transientes pós-sinápticos evocados de cálcio. Isso evita o uso de estimulação elétrica, permitindo uma análise não invasiva de mutantes que afetam a dinâmica pós-sináptica do cálcio.

O GECIS do único-fluorophore, tal como gcamp, usa uma única molécula fluorescente da proteína fundida ao domínio M13 da quinase da corrente clara do miosina em seu fim do N-terminal e no calmodulina (CaM) no C-Terminus. Em cima do emperramento do cálcio, o domínio do CaM, que tem uma afinidade elevada para o cálcio, sofre uma mudança conformacional que induz uma mudança conformacional subseqüente na proteína fluorescente que conduz a um aumento na intensidade¹da fluorescência. GCaMP fluorescência está animado em 488 nm, tornando-se inadequado para ser usado em conjunto com channelrhodopsin, que tem um comprimento de onda de excitação semelhante de 473 nm. Assim, a fim de par de medições de cálcio com a estimulação da channelrhodopsina, a proteína verde fluorescente do GCaMP precisa ser substituída por uma proteína vermelha fluorescente, mRuby (RCaMP). Usando o músculo expressado rcamp, em combinação com a expressão colinérgicos do neurônio do motor do channelrhodopsin, permite estudos na junção neuromuscular do sem-fim (nmj) com uso simultâneo do optogenetics e da imagem latente funcional dentro do mesmo animal ^{o 2}.

O uso de channelrhodopsin ignora a necessidade de a estimulação elétrica despolarizar as junções neuromusculares de C. elegans, que só pode ser alcançada em preparações dissecadas, tornando esta técnica mais fácil de empregar e mais precisa ao segmentar tecidos específicos. Por exemplo, channelrhodopsin tem sido usado anteriormente em C. elegans para ativar os neurônios específicos de forma^{reversível, levando}a uma ativação robusta de neurônios excitatórios ou inibidores^{de inibição}3,4. O uso da despolarização luz-estimulada igualmente contorna a edição de dano neuronal devido à estimulação elétrica direta. Isto fornece uma oportunidade de examinar os efeitos de muitos protocolos diferentes da estimulação, incluindo estimulações sustentadas e repetidas, na dinâmica pós-sináptica do cálcio⁴.

A natureza transparente de C. elegans torna-o ideal para a análise funcional de imagens fluorescentes. No entanto, ao estimular os neurônios excitatórios de acetilcolina na NMJ, espera-se que os animais respondam com uma contração muscular imediata⁴, tornando a imobilização dos vermes críticos na visualização de alterações discretas de cálcio. Tradicionalmente, os agentes farmacológicos têm sido usados para paralisar os animais. Uma tal droga usada é Levamisole, um agonista do receptor de acetilcolina colinérgico^5,6,7. Desde que levamisol conduz à ativação persistente de um SubType de receptores excitatórios do músculo, este reagente é inadequado para o estudo da dinâmica do cálcio do músculo. A ação de levamisol induz a despolarização pós-sináptica, elevando o cálcio citosólico, e obstruindo observações depois da estimulação pré-sináptica. Para evitar o uso de drogas paralisantes, examinamos dois métodos alternativos para imobilizar C. elegans. Os animais foram colados para baixo e, em seguida, dissecado aberto para expor os músculos da parede do corpo, semelhante ao existente C. elegans nmj método de eletrofisiologia⁸, ou nanobeads foram utilizados para imobilizar animais intactos⁹. Ambos os procedimentos permitiram as medidas reprodutíveis dos transientes do cálcio do descanso e do músculo evocado que eram facilmente quantifiable.

Os métodos deste trabalho podem ser utilizados para medir os níveis de cálcio citosólico basal e transientes em células musculares da parede do corpo pós-sináptica em C. elegans. Exemplos de dados empregando as duas técnicas de imobilização diferentes são dadas. Ambas as técnicas aproveitam a optogenética para despolarizar as células musculares sem o uso de estimulação elétrica. Estes exemplos demonstram a viabilidade deste método em avaliar as mutações que afetam o tratamento pós-sináptica do cálcio nos sem-fins e apontam os prós e os contras das duas aproximações da imobilização.