In vivo calcium beeldvorming in C. elegans lichaam muur spieren

Dit document presenteert methoden voor in vivo calcium beeldvorming van C. elegans lichaam wand spieren met behulp van optogenetische neuronale stimulatie. Het koppelen van een spier uitgedrukt genetisch gecodeerde calcium indicator (GECI) met blauw licht veroorzaakte neuronale depolarisatie en biedt een systeem om de Evoked postsynaptisch calcium transiënten duidelijk te observeren. Dit vermijdt het gebruik van elektrische stimulatie, waardoor een niet-invasieve analyse van mutanten die de postsynaptische calcium dynamiek beïnvloeden.

Single-fluorophore GECIs, zoals GCaMP, maakt gebruik van een enkele fluorescerende proteïne molecuul gesmolten tot de M13 domein van myosin Light Chain kinase aan de N-Terminal einde en Calmoduline (CaM) op de C-Terminus. Bij calcium binding ondergaat het CaM-domein, dat een hoge affiniteit heeft met calcium, een conformationele verandering die een daaropvolgende conformationele verandering in het fluorescerende eiwit veroorzaakt, wat leidt tot een toename van de intensiteit van de fluorescentie¹. GCaMP fluorescentie is opgewonden op 488 nm, waardoor het ongeschikt is om te worden gebruikt in combinatie met channelrhodopsin, die een vergelijkbare excitatie golflengte van 473 nm heeft. Daarom moet het groene fluorescerende eiwit van GCaMP worden vervangen door een rood fluorescerende proteïne, mRuby (RCaMP), om de calcium metingen met channelrhodopsine stimulatie te kunnen koppel. Met behulp van de spier uitgedrukt RCaMP, in combinatie met de cholinerge motorische neuron expressie van channelrhodopsin, maakt studies mogelijk op de worm neuromusculaire kruising (NMJ) met gelijktijdig gebruik van optogenetica en functionele beeldvorming binnen hetzelfde dier ².

Het gebruik van channelrhodopsin omzeilt de noodzaak van de elektrische stimulatie om de neuromusculaire knooppunten van C. eleganste depolariseren, wat alleen kan worden bereikt in ontleed preparaten, waardoor deze techniek zowel eenvoudiger in gebruik en preciezer bij het targeten van specifieke weefsels. Bijvoorbeeld, channelrhodopsin is eerder gebruikt in C. elegans om reversibel activeren specifieke neuronen, leidt tot ofwel robuuste activering van excitatory of remmende neuronen^3,4. Het gebruik van lichtgestimuleerde depolarisatie omzeilt ook de kwestie van neuronale schade als gevolg van de directe elektrische stimulatie. Dit biedt de mogelijkheid om de effecten van veel verschillende stimulatie protocollen, met inbegrip van aanhoudende en herhaalde stimulaties, op postsynaptisch calcium Dynamics⁴te onderzoeken.

Het transparante karakter van C. elegans maakt het ideaal voor de fluorescerende beeldvormende functionaalanalyse. Echter, bij het stimuleren van de excitatory acetylcholine neuronen op de NMJ, dieren worden verwacht te reageren met een onmiddellijke spiercontractie⁴, waardoor de immobilisatie van de wormen kritisch in het visualiseren van discrete calcium veranderingen. Traditioneel, farmacologische agenten zijn gebruikt voor het verlammen van de dieren. Een dergelijke drug gebruikt is Levamisole, een cholinerge acetylcholine receptor agonist^5,6,7. Aangezien levamisol leidt tot de aanhoudende activering van een subtype van excitatory spier receptoren, is dit reagens ongeschikt voor de studie van de spier calcium dynamiek. De werking van levamisol induceert postsynaptische depolarisatie, verheffende het cytosolische calcium en occluderende waarnemingen na presynaptische stimulatie. Om het gebruik van verlamde drugs te voorkomen, we onderzochten twee alternatieve methoden om te immobiliseren C. elegans. Dieren werden ofwel gelijmd en vervolgens ontleed open om de lichaamsspieren bloot te stellen, vergelijkbaar met de bestaande C. elegans nmj elektrofysiologie methode⁸, of nano kralen werden gebruikt om intacte dieren te immobiliseren⁹. Beide procedures toegestaan voor de reproduceerbare metingen van de rust en Evoked spier calcium transiënten die gemakkelijk kwantificeerbaar waren.

De methoden in dit papier kunnen worden gebruikt om de baseline cytosolische calciumspiegels en transiënten in postsynaptisch Body Wall spiercellen in C. eleganste meten. Voorbeelden van gegevens met de twee verschillende immobilisatie technieken worden gegeven. Beide technieken maken gebruik van optogenetics om de spiercellen te depolariseren zonder het gebruik van elektrische stimulatie. Deze voorbeelden tonen de haalbaarheid van deze methode aan bij het evalueren van mutaties die de postsynaptische behandeling van calcium in de wormen beïnvloeden en wijzen op de voors en tegens van de twee immobilisatie benaderingen.