שיטה זו מספקת דרך לזוג אלקטרואופטיקה וחיישני סידן מקודד גנטית לתמונה בסיסית ציטוסולג רמות סידן ושינויים בארעיות הסידן מעורר בשרירי הגוף של האורגניזם מודל ג. אלגיה.
האורגניזם מודל C. אלגיה מספק מערכת מעולה לבצע הדמיה vivo סידן. הגוף השקוף והmanipulability הגנטי שלו מאפשרים ביטוי ממוקד של חיישני סידן מקודדים גנטית. פרוטוקול זה מתאר את השימוש בחיישנים אלה עבור הדמיה vivo של הדינמיקה סידן בתאים ייעודיים, במיוחד שרירי הגוף של התולעים. על ידי ניצול הביטוי המשותף של המתקשר הטרום סינפטיות, גירוי של שחרור אצטילכולין מפני הנוירונים מוטוריים מוטורי יכול להיגרם באמצעות פולסים באור כחול, וכתוצאה מכך שרירים depolarization שריר ושינויים בסידן cytoplasmic רמות. שתי טכניקות השתק התולעים נידונות עם רמות שונות של קושי. השוואה בין טכניקות אלה ממחישה כי שתי הגישות משמרות את הפיזיולוגיה של הצומת העצבי ומאפשרים לכמת את הסידן. על-ידי שיוך אלקטרואופטיקה והדמיה של סידן פונקציונלי, שינויים בטיפול בסידן פוסט-סינפטית והומאוסטזיס ניתן להעריך במגוון של רקעים מוטציה. הנתונים המוצגים מאמתת הן טכניקות השתק ובודקת באופן ספציפי את התפקידים של C. אלגיה sarco (לאנדו) פלמיק סידן ATPase ואת הסידן מופעל בערוץ האשלגן המופעל בתוך שריר קיר הגוף בוויסות הסידן.
נייר זה מציג שיטות לדימות סידן vivo של C. אלגיה שרירי קיר הגוף באמצעות הגירוי העצבי הגנטי. זיווג שריר הביע מחוון סידן מקודד גנטית (סמא) עם אור כחול המופעל הנוירופולריזציה והוא מספק מערכת להתבונן בבירור את הארעיות מעורר הסידן סינפטית. זה מונע את השימוש בגירוי חשמלי, המאפשר ניתוח לא פולשני של מוטציות המשפיעות על הדינמיקה סידן פוסט סינפטית.
חד-פלואורוופפור, כגון gcamp, משתמש במולקולה אחת של חלבון פלורסנט התמזגו לתחום M13 של רירן שרשרת האור בקצה N-terminal שלה ו קלמודולין (CaM) ב C-טרמינוס. עם כריכת סידן, התחום CaM, אשר יש זיקה גבוהה לסידן, עובר שינוי הקונפורמציה גרימת שינוי מאוחר יותר בחלבון פלורסנט המוביל להגדיל את עוצמת הקרינה הפלואורסצנטית1. GCaMP הזריחה הוא נרגש ב 488 ננומטר, מה שהופך אותו לא מתאים לשמש בשילוב עם המתקשרים, אשר יש גל עירור דומה של 473 ננומטר. כך, על מנת למספר מדידות סידן עם גירוי מתקשר, חלבון פלורסנט ירוק של GCaMP צריך להיות מוחלף עם חלבון פלורסנט אדום, mRuby (RCaMP). באמצעות שריר הביע את RCaMP, בשילוב עם ביטוי הcholinergic המנוע המוטוריים של המתקשרים, היתרי לימודים בצומת הנוירוסקולריות התולעת (NMJ) עם שימוש סימולטני של אלקטרואופטיקה והדמיה פונקציונלית בתוך אותה חיה 2. שתיים.
השימוש במתקשרים עוקף את הצורך בגירוי החשמלי כדי לפשט את הצמתים הנוירוולוגיים של ה -אס. אס.אס, שניתן להשיג רק באופן גזור, ובכך להפוך טכניקה זו לקלה יותר ומדויקת יותר בעת התמקדות ברקמות ספציפיות. לדוגמה, המתקשרים השתמשו בעבר ב -C. אלגיה כדי להפעיל נוירונים מסוימים באופן הפיך, המוביל להפעלה חזקה של הנוירונים או מעכבות הניריונים3,4. השימוש בדפולריזציה מגורה גם חוסם את סוגיית הנזק העצבי בשל גירוי חשמלי ישיר. זה מספק הזדמנות לבחון את ההשפעות של פרוטוקולי גירוי שונים רבים, כולל הגירוי מתמשכת וחוזרים, על הדינמיקה הסידן פוסט סינפטית4.
האופי השקוף של הג הופך אותו לאידיאלי עבור האנליזה הפונקציונלית של ההדמיה הפלואורסצנטית. עם זאת, כאשר מגרה את הנוירונים הNMJ הממריצים בבית הספרים, בעלי חיים צפויים להגיב עם כיווץ שרירים מיידי4, מה שהופך את השתק של תולעים קריטי להמחיש שינויי סידן דיסקרטית. באופן מסורתי, סוכני תרופתי. שימשו כדי לשתק את החיות אחד תרופה כזאת בשימוש הוא levamisole, קולטן cholinergic אצטילכולין האגוניסט5,6,7. מאז levamisole מוביל הפעלה מתמדת של תת סוג של קולטני שריר מרגש, מגיב זה אינו מתאים למחקר של הדינמיקה סידן שרירים. הפעולה של levamisole מעוררת הדפולריזציה הפוסט, מרוממת את הסידן ציטוסולג, וסגר תצפיות בעקבות גירוי טרום סינפטיות. כדי להימנע משימוש בסמים משתקת, בדקנו שתי שיטות חלופיות כדי לשתק את הג. בעלי חיים היו מודבקים למטה ולאחר מכן לגזור לחשוף את שרירי הקיר הגוף, בדומה C. אלגיה NMJ אלקטרופיזיולוגיה שיטה8, או nanobeads שימשו לשתק בעלי חיים שלמים9. שני ההליכים מותר עבור מדידות הניתנות לכימות של השריר מנוחה ומעורר משני השרירים המשורשים שהיו בקלות ככמת.
השיטות בנייר זה ניתן להשתמש כדי למדוד את רמות הסידן בסיסית ציטוטים ו ארעיות בתאי גוף השריר הפוסט-סינפטיות ב- C. אלגיה. דוגמאות לנתונים המעסיקים את שתי טכניקות השתק השונות ניתנות. שתי טכניקות לנצל אלקטרואופטיקה כדי לחסל את תאי השריר ללא שימוש בגירוי חשמלי. דוגמאות אלה מדגימות את הכדאיות של שיטה זו בהערכת מוטציות המשפיעות על טיפול בסידן פוסט-סינפטית בתולעים ומצביעים על היתרונות והחסרונות של שתי גישות השתק.
הסמנים הם כלי רב-עוצמה בנוירוביולוגיה. עבודה קודמת יש שימוש בטכניקות הדמיה סידן כדי לבחון מגוון רחב של פונקציות הן נוירונים ותאי שריר, כולל תגובות חישה והתנהגותית, עם שיטות מגוונות של גירוי. מחקרים מסוימים השתמשו גירויים כימיים כדי להפעיל מארעיות סידן בנוירונים אפר חושי22</su…
The authors have nothing to disclose.
המחברים מודים לד ר אלכסנדר גוטשאלק עבור ZX1659, RCaMP והמתקשרים המכילים זן התולעת, ד ר Hongkyun קים עבור מאמץ התולעת איטי-1 (eg142) , ואת הפרויקט הלאומי Bioresource עבור מאמץ של לסרוק -1 (tm5339) תולעת.
all-trans retinal | Sigma-Aldrich | R2500 | Necessary for excitation of channel rhodopsin |
Amber LED | RCaMP illumination | ||
Arduino UNO | Mouser | 782-A000066 | Controls fluorescence illumination |
Blue LED | channelrhodopsin illumination | ||
BX51WI microscope | Olympus | Fixed state compound microscope | |
Current controlled low noise linear power supply | Ametek | Sorenson | Controls LED intensity |
Igor Pro | Wavemetrics | Wavemetrics.com | Graphing software |
ImageJ | NIH | imagej.nih.gov | Image processing software |
LUMFLN 60x water NA 1.4 | Olympus | Water immersion objective for dissected preparation | |
Master-8 Stimulator | A.M.P.I | Master timer for image acquisition and LED illumination | |
Micro-Manager | micro-manager.org | Controls camera acquisition and LED excitiation | |
Microsoft Excel | Microsoft | Spreadsheet software | |
pco.edge 4.2 CMOS camera | pco. | 4.2 | High-speed camera |
PlanApo N 60x oil NA 1.4 | Olympus | Oil immersion objective for nanobead preparation | |
Polybead microspheres | Polysciences, Inc. | 00876-15 | For worm immobilization |
solid state switches | Sensata Technologies | Crydom CMX100D6 | Controls timing of LED illumination |
Transgenic strain, sca-1(tm5339); [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35] |
Richmond Lab | SY1627 | Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line with SERCA mutant allele |
Transgenic strain, slo-1 (eg142); [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35] |
Richmond Lab | Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line with calcium-activated BK potassium channel mutant allele | |
Transgeneic strain, [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35] |
Gottschalk Lab | ZX1659 | Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line |