Summary

בשנת הדמיה Vivo סידן בג. אלגיה שרירי הגוף

Published: October 20, 2019
doi:

Summary

שיטה זו מספקת דרך לזוג אלקטרואופטיקה וחיישני סידן מקודד גנטית לתמונה בסיסית ציטוסולג רמות סידן ושינויים בארעיות הסידן מעורר בשרירי הגוף של האורגניזם מודל ג. אלגיה.

Abstract

האורגניזם מודל C. אלגיה מספק מערכת מעולה לבצע הדמיה vivo סידן. הגוף השקוף והmanipulability הגנטי שלו מאפשרים ביטוי ממוקד של חיישני סידן מקודדים גנטית. פרוטוקול זה מתאר את השימוש בחיישנים אלה עבור הדמיה vivo של הדינמיקה סידן בתאים ייעודיים, במיוחד שרירי הגוף של התולעים. על ידי ניצול הביטוי המשותף של המתקשר הטרום סינפטיות, גירוי של שחרור אצטילכולין מפני הנוירונים מוטוריים מוטורי יכול להיגרם באמצעות פולסים באור כחול, וכתוצאה מכך שרירים depolarization שריר ושינויים בסידן cytoplasmic רמות. שתי טכניקות השתק התולעים נידונות עם רמות שונות של קושי. השוואה בין טכניקות אלה ממחישה כי שתי הגישות משמרות את הפיזיולוגיה של הצומת העצבי ומאפשרים לכמת את הסידן. על-ידי שיוך אלקטרואופטיקה והדמיה של סידן פונקציונלי, שינויים בטיפול בסידן פוסט-סינפטית והומאוסטזיס ניתן להעריך במגוון של רקעים מוטציה. הנתונים המוצגים מאמתת הן טכניקות השתק ובודקת באופן ספציפי את התפקידים של C. אלגיה sarco (לאנדו) פלמיק סידן ATPase ואת הסידן מופעל בערוץ האשלגן המופעל בתוך שריר קיר הגוף בוויסות הסידן.

Introduction

נייר זה מציג שיטות לדימות סידן vivo של C. אלגיה שרירי קיר הגוף באמצעות הגירוי העצבי הגנטי. זיווג שריר הביע מחוון סידן מקודד גנטית (סמא) עם אור כחול המופעל הנוירופולריזציה והוא מספק מערכת להתבונן בבירור את הארעיות מעורר הסידן סינפטית. זה מונע את השימוש בגירוי חשמלי, המאפשר ניתוח לא פולשני של מוטציות המשפיעות על הדינמיקה סידן פוסט סינפטית.

חד-פלואורוופפור, כגון gcamp, משתמש במולקולה אחת של חלבון פלורסנט התמזגו לתחום M13 של רירן שרשרת האור בקצה N-terminal שלה ו קלמודולין (CaM) ב C-טרמינוס. עם כריכת סידן, התחום CaM, אשר יש זיקה גבוהה לסידן, עובר שינוי הקונפורמציה גרימת שינוי מאוחר יותר בחלבון פלורסנט המוביל להגדיל את עוצמת הקרינה הפלואורסצנטית1. GCaMP הזריחה הוא נרגש ב 488 ננומטר, מה שהופך אותו לא מתאים לשמש בשילוב עם המתקשרים, אשר יש גל עירור דומה של 473 ננומטר. כך, על מנת למספר מדידות סידן עם גירוי מתקשר, חלבון פלורסנט ירוק של GCaMP צריך להיות מוחלף עם חלבון פלורסנט אדום, mRuby (RCaMP). באמצעות שריר הביע את RCaMP, בשילוב עם ביטוי הcholinergic המנוע המוטוריים של המתקשרים, היתרי לימודים בצומת הנוירוסקולריות התולעת (NMJ) עם שימוש סימולטני של אלקטרואופטיקה והדמיה פונקציונלית בתוך אותה חיה 2. שתיים.

השימוש במתקשרים עוקף את הצורך בגירוי החשמלי כדי לפשט את הצמתים הנוירוולוגיים של ה -אס. אס.אס, שניתן להשיג רק באופן גזור, ובכך להפוך טכניקה זו לקלה יותר ומדויקת יותר בעת התמקדות ברקמות ספציפיות. לדוגמה, המתקשרים השתמשו בעבר ב -C. אלגיה כדי להפעיל נוירונים מסוימים באופן הפיך, המוביל להפעלה חזקה של הנוירונים או מעכבות הניריונים3,4. השימוש בדפולריזציה מגורה גם חוסם את סוגיית הנזק העצבי בשל גירוי חשמלי ישיר. זה מספק הזדמנות לבחון את ההשפעות של פרוטוקולי גירוי שונים רבים, כולל הגירוי מתמשכת וחוזרים, על הדינמיקה הסידן פוסט סינפטית4.

האופי השקוף של הג הופך אותו לאידיאלי עבור האנליזה הפונקציונלית של ההדמיה הפלואורסצנטית. עם זאת, כאשר מגרה את הנוירונים הNMJ הממריצים בבית הספרים, בעלי חיים צפויים להגיב עם כיווץ שרירים מיידי4, מה שהופך את השתק של תולעים קריטי להמחיש שינויי סידן דיסקרטית. באופן מסורתי, סוכני תרופתי. שימשו כדי לשתק את החיות אחד תרופה כזאת בשימוש הוא levamisole, קולטן cholinergic אצטילכולין האגוניסט5,6,7. מאז levamisole מוביל הפעלה מתמדת של תת סוג של קולטני שריר מרגש, מגיב זה אינו מתאים למחקר של הדינמיקה סידן שרירים. הפעולה של levamisole מעוררת הדפולריזציה הפוסט, מרוממת את הסידן ציטוסולג, וסגר תצפיות בעקבות גירוי טרום סינפטיות. כדי להימנע משימוש בסמים משתקת, בדקנו שתי שיטות חלופיות כדי לשתק את הג. בעלי חיים היו מודבקים למטה ולאחר מכן לגזור לחשוף את שרירי הקיר הגוף, בדומה C. אלגיה NMJ אלקטרופיזיולוגיה שיטה8, או nanobeads שימשו לשתק בעלי חיים שלמים9. שני ההליכים מותר עבור מדידות הניתנות לכימות של השריר מנוחה ומעורר משני השרירים המשורשים שהיו בקלות ככמת.

השיטות בנייר זה ניתן להשתמש כדי למדוד את רמות הסידן בסיסית ציטוטים ו ארעיות בתאי גוף השריר הפוסט-סינפטיות ב- C. אלגיה. דוגמאות לנתונים המעסיקים את שתי טכניקות השתק השונות ניתנות. שתי טכניקות לנצל אלקטרואופטיקה כדי לחסל את תאי השריר ללא שימוש בגירוי חשמלי. דוגמאות אלה מדגימות את הכדאיות של שיטה זו בהערכת מוטציות המשפיעות על טיפול בסידן פוסט-סינפטית בתולעים ומצביעים על היתרונות והחסרונות של שתי גישות השתק.

Protocol

1. התקנת מיקרוסקופ השתמש במיקרוסקופ מורכב עם יכולות של קרינה פלואורסצנטית. עבור מחקר זה, הנתונים נאספו על מיקרוסקופ זקוף (טבלת חומרים) מצויד נוריות עבור עירור. כדי להמחיש כראוי שינויים בעלי קרינה פלואורסצנטית שרירי הגוף, להשתמש במטרה הגדלה גבוהה. לקראת ההכנות לגזור…

Representative Results

טכניקה זו העריכה שינויים מוטציות חשבו להשפיע על טיפול בסידן או depolarization השריר. רמות הניאון הבסיסית ו ארעיות פלורסנט היו דמיינו ומנוחה cytosolic סידן וקינטיקה סידן בתוך השריר הוערכו. חשוב כי החיות גדלו על הרשתית כל הטרנס לפחות שלושה ימים כדי להבטיח את התאגדות מוצלחת של הרשתית, …

Discussion

הסמנים הם כלי רב-עוצמה בנוירוביולוגיה. עבודה קודמת יש שימוש בטכניקות הדמיה סידן כדי לבחון מגוון רחב של פונקציות הן נוירונים ותאי שריר, כולל תגובות חישה והתנהגותית, עם שיטות מגוונות של גירוי. מחקרים מסוימים השתמשו גירויים כימיים כדי להפעיל מארעיות סידן בנוירונים אפר חושי22</su…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחברים מודים לד ר אלכסנדר גוטשאלק עבור ZX1659, RCaMP והמתקשרים המכילים זן התולעת, ד ר Hongkyun קים עבור מאמץ התולעת איטי-1 (eg142) , ואת הפרויקט הלאומי Bioresource עבור מאמץ של לסרוק -1 (tm5339) תולעת.

Materials

all-trans retinal Sigma-Aldrich R2500 Necessary for excitation of channel rhodopsin
Amber LED RCaMP illumination
Arduino UNO Mouser 782-A000066 Controls fluorescence illumination
Blue LED channelrhodopsin illumination
BX51WI microscope Olympus Fixed state compound microscope
Current controlled low noise linear power supply Ametek Sorenson Controls LED intensity
Igor Pro Wavemetrics Wavemetrics.com Graphing software
ImageJ NIH imagej.nih.gov Image processing software
LUMFLN 60x water NA 1.4 Olympus Water immersion objective for dissected preparation
Master-8 Stimulator A.M.P.I Master timer for image acquisition and LED illumination
Micro-Manager micro-manager.org Controls camera acquisition and LED excitiation
Microsoft Excel Microsoft Spreadsheet software
pco.edge 4.2 CMOS camera pco. 4.2 High-speed camera
PlanApo N 60x oil NA 1.4 Olympus Oil immersion objective for nanobead preparation
Polybead microspheres Polysciences, Inc. 00876-15 For worm immobilization
solid state switches Sensata Technologies Crydom CMX100D6 Controls timing of LED illumination
Transgenic strain, sca-1(tm5339); [zxIs6{Punc17::chop-2
(h134R)::yfp,lin-15(+)};
Pmyo3::RCaMP35
]
Richmond Lab SY1627 Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line with SERCA mutant allele
Transgenic strain, slo-1 (eg142); [zxIs6{Punc17::chop-2
(h134R)::yfp,lin-15(+)};
Pmyo3::RCaMP35
]
Richmond Lab Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line with calcium-activated BK potassium channel mutant allele
Transgeneic strain, [zxIs6{Punc17::chop-2
(h134R)::yfp,lin-15(+)};
Pmyo3::RCaMP35
]
Gottschalk Lab ZX1659 Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line

References

  1. Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca2+ probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
  2. Akerboom, J., et al. Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics. Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 1-29 (2013).
  3. Nagel, G., et al. Light Activation of Channelrhodopsin-2 in Excitable Cells of Caenorhabditis elegans Triggers Rapid Behavioral Responses. Current Biology. 15 (24), 2279-2284 (2005).
  4. Liewald, J. F., et al. Optogenetic analysis of synaptic function. Nature Methods. 5 (10), 895-902 (2008).
  5. Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D. T., Bargmann, C. I., Avery, L. Laser Microsurgery in Caenorhabditis elegans. Methods Cell Biology. 107, 177-206 (2012).
  6. Lewis, J. A., et al. Cholinergic Receptor Mutants of the Nematode Caenorhabditis elegans. The Journal of Neuroscience. 7 (10), 3059-3071 (1987).
  7. Lewis, J. A., Wu, C. H., Berg, H., Levine, J. H. The genetics of levamisole resistance in the nematode Caenorhabditis elegans. Genetics. 95 (4), 905-928 (1980).
  8. Richmond, J. E., Jorgensen, E. M. One GABA and two acetylcholine receptors function at the C. elegans neuromuscular junction. Nature Neuroscience. 9, 791-798 (1999).
  9. Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. Long-Term Imaging of Caenorhabditis elegans Using Nanoparticle-Mediated Immobilization. PLoS ONE. 8 (1), 1-6 (2013).
  10. Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. Computer control of microscopes using umanager. Current Protocols in Molecular Biology. (Suppl 92), 1-17 (2010).
  11. Richmond, J. Dissecting and Recording from The C. Elegans Neuromuscular Junction. Journal of Visualized Experiments. (24), 1-4 (2009).
  12. Hoon Cho, J., Bandyopadhyay, J., Lee, J., Park, C. S., Ahnn, J. Two isoforms of sarco/endoplasmic reticulum calcium ATPase (SERCA) are essential in Caenorhabditis elegans. Gene. 261, 211-219 (2000).
  13. Zwaal, R. R., et al. The Sarco-Endoplasmic Reticulum Ca2+ ATPase Is Required for Development and Muscle Function in Caenorhabditis elegans. The Journal of Biological Chemistry. 276 (47), 43557-43563 (2001).
  14. Stammers, A. N., et al. The regulation of sarco(endo)plasmic reticulum calcium-ATPases (SERCA). Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 93, 1-12 (2015).
  15. Clapham, D. E. Calcium Signaling. Cell. 131, 1047-1058 (2007).
  16. Hovnanian, A. Serca pumps and human diseases. Calcium Signalling and Disease: Molecular Pathology of Calcium. , 337-363 (2007).
  17. Periasamy, M., Kalyanasundaram, A. SERCA pump isoforms: Their role in calcium transport and disease. Muscle and Nerve. 35 (4), 430-442 (2007).
  18. Gehlert, S., Bloch, W., Suhr, F. Ca2+-Dependent Regulations and Signaling in Skeletal Muscle: From Electro-Mechanical Coupling to Adaptation. International Journal of Molecular Sciences. 16, 1066-1095 (2015).
  19. Martin, A. A., Richmond, J. E. The sarco(endo)plasmic reticulum calcium ATPase SCA-1 regulates the Caenorhabditis elegans nicotinic acetylcholine receptor ACR-16. Cell Calcium. 72, 104-115 (2018).
  20. Wang, Z., Saifee, O., Nonet, M. L., Salkoff, L. SLO-1 Potassium Channels Control Quantal Content of Neurotransmitter Release at the C. elegans Neuromuscular Junction. Neuron. 32, 867-881 (2001).
  21. Abraham, L. S., Oh, H. J., Sancar, F., Richmond, J. E., Kim, H. An Alpha-Catulin Homologue Controls Neuromuscular Function through Localization of the Dystrophin Complex and BK Channels in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 6 (8), 1-13 (2010).
  22. Gourgou, E., Chronis, N. Chemically induced oxidative stress affects ASH neuronal function and behavior in C. elegans. Scientific Reports. 6, 1-9 (2016).
  23. Zahratka, J. A., Williams, P. D. E., Summers, P. J., Komuniecki, R. W., Bamber, B. A. Serotonin differentially modulates Ca2+ transients and depolarization in a C. elegans nociceptor. Journal of Neurophysiology. 113 (4), 1041-1050 (2015).
  24. Kerr, R., et al. Optical imaging of calcium transients in neurons and pharyngeal muscle of C. elegans. Neuron. 26 (3), 583-594 (2000).
  25. Nekimken, A. L., et al. Pneumatic stimulation of C. elegans mechanoreceptor neurons in a microfluidic trap. Lab Chip. 17 (6), 1116-1127 (2017).
  26. Chung, S. H., Sun, L., Gabel, C. V. In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans. Journal of Visualized Experiments. (74), 1-9 (2013).
  27. Jospin, M., Jacquemond, V., Mariol, M. C., Ségalat, L., Allard, B. The L-type voltage-dependent Ca2+channel EGL-19 controls body wall muscle function in Caenorhabditis elegans. Journal of Cell Biology. 159 (2), 337-347 (2002).
  28. Wabnig, S., Liewald, J. F., Yu, S., Gottschalk, A. High-Throughput All-Optical Analysis of Synaptic Transmission and Synaptic Vesicle Recycling in Caenorhabditis elegans. PLoS ONE. , 1-26 (2015).

Play Video

Cite This Article
Martin, A. A., Alford, S., Richmond, J. E. In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles. J. Vis. Exp. (152), e59175, doi:10.3791/59175 (2019).

View Video