في فيفو الكالسيوم التصوير في c. الهيئة عضلات الجدار الجسم
Summary
هذا الأسلوب يوفر وسيله للزوجين optogenetics والمشفرة وراثيا مجسات الكالسيوم إلى مستويات الكالسيوم القاعدية صوره الأساس والتغيرات في العابرين الكالسيوم أثارت في عضلات الجسم الجدار من الكائن الحي النموذجي c. اليجنتس.
Abstract
يوفر نموذج الكائن الحي c. اليجانقاف نظاما ممتازا لأداء التصوير بالكالسيوم في الجسم. وتسمح هيئته الشفافة وقدرته علي التلاعب الوراثي بالتعبير المستهدف لأجهزه استشعار الكالسيوم المشفرة وراثيا. يحدد هذا البروتوكول استخدام أجهزه الاستشعار هذه لتصوير ديناميات الكالسيوم في الخلايا المستهدفة ، وعلي وجه التحديد عضلات جدار الجسم في الديدان. من خلال الاستفادة من التعبير المشترك لل بريسينابتيك تشانيلروبوبسين, تحفيز الإفراج عن استيل من الخلايا العصبية الحركية المثيرة يمكن ان يكون مستحثا باستخدام نبضات الضوء الأزرق, مما ادي إلى الاستقطاب العضلات والتغييرات القابلة للتكرار في الكالسيوم سيتوبلازمي مستويات. يتم مناقشه اثنين من تقنيات التجميد دوده مع مستويات متفاوتة من الصعوبة. وتبين المقارنة بين هذه التقنيات ان كلا النهجين يحافظان علي فسيولوجيا التقاطع العصبي العضلي ويسمح بالكمية القابلة للتكرار لعابري الكالسيوم. عن طريق الاقتران optogenetics والتصوير الوظيفي الكالسيوم ، ويمكن تقييم التغييرات في التعامل مع الكالسيوم بوستسينابتيك والتوازن في مجموعه متنوعة من الخلفيات متحولة. البيانات المقدمة بالتحقق من صحة كل من تقنيات التعبئة ويفحص علي وجه التحديد ادوار ساركو سي (اندو) بلازمي شبكي الكالسيوم ATPase وقناه البوتاسيوم BK تنشيط الكالسيوم في الجسم جدار العضلات تنظيم الكالسيوم.
Introduction
تقدم هذه الورقة طرقا لتصوير الكالسيوم في الجسم باستخدام عضلات جدار الهيكل c. التي تستخدم تحفيز الخلايا العصبية أوبتوجينيتيك. الاقتران العضلات التي أعرب عنها وراثيا المشفرة مؤشر الكالسيوم (جيكط) مع الضوء الأزرق أثارت الاستقطاب العصبية ويوفر نظاما لمراقبه بوضوح العابرين الكالسيوم التي أثيرت بعد المتشابك. هذا يتجنب استخدام التحفيز الكهربائي, السماح للتحليل غير الغازية من المسوخ التي تؤثر علي ديناميات الكالسيوم بوستمتشابك.
واحد-فلوكوفيري جيكسيس ، مثل gcamp ، يستخدم جزيء بروتين فلوري واحد تنصهر في مجال M13 من سلسله الضوء ميوسين كيناز في نهايته N-الطرفية و كالموديولين (CaM) في C-المحطة. علي الكالسيوم ملزمه ، والمجال كام ، والتي لديها تقارب عاليه للكالسيوم ، يخضع لتغيير المطابقة يحفز تغيير المطابقة اللاحقة في البروتين الفلورسنت مما يؤدي إلى زيادة في كثافة مضان1. ومتحمس GCaMP مضان في 488 نانومتر ، مما يجعلها غير صالحه لاستخدامها بالتزامن مع تشانيلروببسين ، الذي يحتوي علي الطول الموجي الاثاره مماثله من 473 نانومتر. التالي ، من أجل القياسات الكالسيوم زوجين مع تحفيز تشانيلروببسين ، البروتين الفلوري الأخضر من GCaMP يحتاج إلى استبداله ببروتين فلوري احمر ، mRuby (ركامب). باستخدام العضلات وأعرب RCaMP, في تركيبه مع التعبير العصبية الحركية الكوليني من تشانيلروبيبسين, يسمح الدراسات في تقاطع العصبية العضلية (NMJ) مع الاستخدام المتزامن لoptogenetics والتصوير الوظيفي داخل نفس الحيوانية 2–
استخدام تشانيلروبوبسين يتجاوز الحاجة إلى التحفيز الكهربائي لتشويه الوصلات العصبية العضلية من c. اليجانيس، والتي يمكن ان تتحقق الا في الاستعدادات تشريح ، مما يجعل هذه التقنية علي حد سواء أسهل لتوظيف وأكثر دقه عند استهداف انسجه معينه. علي سبيل المثال, وقد استخدمت في السابق تشانيلروببسين في c. اليجنس لتنشيط الخلايا العصبية المحددة بشكل عكسي, مما يؤدي إلى تنشيط قويه من الخلايا العصبية مثير أو المثبطة3,4. كما ان استخدام الاستقطاب المحفز للضوء يلتف أيضا علي مساله تلف الخلايا العصبية بسبب التحفيز الكهربائي المباشر. وهذا يوفر فرصه لدراسة اثار العديد من بروتوكولات التحفيز المختلفة, بما في ذلك المحفزات المستمرة والمتكررة, علي ديناميات الكالسيوم بوستمتشابك4.
ان الطبيعة الشفافة لل c. اليجايليس تجعله مثاليا للتحليل الوظيفي للتصوير الفلوري. ومع ذلك, عند تحفيز الخلايا العصبية المثيرة استيل في NMJ, ومن المتوقع الحيوانية للرد مع انكماش العضلات الفورية4, مما يجعل من تجميد الديدان الحرجة في تصور تغيرات الكالسيوم منفصلة. تقليديا ، وقد استخدمت وكلاء الدوائية لشل الماشية. واحد مثل هذه المخدرات المستخدمة هو levamisole, وهو اتروبين مستقبلات استيل الكولين5,6,7. منذ الليفاميزول يؤدي إلى التنشيط المستمر لنوع فرعي من مستقبلات العضلات مثير, هذا الكاشف غير مناسب لدراسة ديناميات الكالسيوم العضلات. العمل ليفيسيزول يدفع الاستقطاب بوستسينابتيك ، ورفع الكالسيوم عصاري خلوي ، والملاحظات انسداد بعد التحفيز بريسينابتيك. لتجنب استخدام الادويه المشلولة ، قمنا بفحص طريقتين بديلتين لتعبئة c. اليجايليس. تم لصقها الحيوانية اما أسفل ومن ثم تشريح مفتوحة لفضح عضلات الجسم الجدار ، علي غرار القائمة c. اليجانقاف nmj الكهربائية الطريقة8، أو استخدمت نانوبيادس لشل الكائنات السليمة9. سمح كلا الإجراءات للقياسات استنساخه من يستريح وأثار العضلات الكالسيوم العابرين التي كانت قابله للقياس بسهوله.
الطرق في هذه الورقة يمكن استخدامها لقياس مستويات الكالسيوم القاعدية السيتووليك والعابرين في خلايا العضلات الجدار الجسم بوستمتشابك في c. الايليسين. وترد أمثله للبيانات التي تستخدم التقنيتين المختلفتين للتعبئة. كلا التقنيتين الاستفادة من optogenetics لتشويه الخلايا العضلية دون استخدام التحفيز الكهربائي. وتبين هذه الامثله جدوى هذه الطريقة في تقييم الطفرات التي تؤثر علي معالجه الكالسيوم بعد المتشابك في الديدان وتشير إلى إيجابيات وسلبيات النهجين التجميد.
Protocol
Representative Results
Discussion
جيكاس هي أداه قويه في البيولوجيا العصبية c. اليجس . وقد استخدمت الاعمال السابقة تقنيات تصوير الكالسيوم لفحص مجموعه واسعه من الوظائف في كل من الخلايا العصبية والعضلات ، بما في ذلك الاستجابات الحسية والسلوكية ، مع أساليب متنوعة من التحفيز. وقد استخدمت بعض الدراسات المحفزات الكيميائية ل…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويشكر المؤلفان الدكتور الكسندر غورسكهالك علي ZX1659 ، والمعسكر الذي يحتوي علي سلاله دوده ، والدكتور هونغكيون كيم لسلاله الدودة البطيءه-1 (eg142) ، والمشروع الوطني للموارد البيولوجية لسلاله الدودة sca-1 (tm5339) .
Materials
| all-trans retinal | Sigma-Aldrich | R2500 | Necessary for excitation of channel rhodopsin |
| Amber LED | RCaMP illumination | ||
| Arduino UNO | Mouser | 782-A000066 | Controls fluorescence illumination |
| Blue LED | channelrhodopsin illumination | ||
| BX51WI microscope | Olympus | Fixed state compound microscope | |
| Current controlled low noise linear power supply | Ametek | Sorenson | Controls LED intensity |
| Igor Pro | Wavemetrics | Wavemetrics.com | Graphing software |
| ImageJ | NIH | imagej.nih.gov | Image processing software |
| LUMFLN 60x water NA 1.4 | Olympus | Water immersion objective for dissected preparation | |
| Master-8 Stimulator | A.M.P.I | Master timer for image acquisition and LED illumination | |
| Micro-Manager | micro-manager.org | Controls camera acquisition and LED excitiation | |
| Microsoft Excel | Microsoft | Spreadsheet software | |
| pco.edge 4.2 CMOS camera | pco. | 4.2 | High-speed camera |
| PlanApo N 60x oil NA 1.4 | Olympus | Oil immersion objective for nanobead preparation | |
| Polybead microspheres | Polysciences, Inc. | 00876-15 | For worm immobilization |
| solid state switches | Sensata Technologies | Crydom CMX100D6 | Controls timing of LED illumination |
| Transgenic strain, sca-1(tm5339); [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35] |
Richmond Lab | SY1627 | Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line with SERCA mutant allele |
| Transgenic strain, slo-1 (eg142); [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35] |
Richmond Lab | Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line with calcium-activated BK potassium channel mutant allele | |
| Transgeneic strain, [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35] |
Gottschalk Lab | ZX1659 | Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line |
References
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca2+ probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
- Akerboom, J., et al. Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics. Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 1-29 (2013).
- Nagel, G., et al. Light Activation of Channelrhodopsin-2 in Excitable Cells of Caenorhabditis elegans Triggers Rapid Behavioral Responses. Current Biology. 15 (24), 2279-2284 (2005).
- Liewald, J. F., et al. Optogenetic analysis of synaptic function. Nature Methods. 5 (10), 895-902 (2008).
- Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D. T., Bargmann, C. I., Avery, L. Laser Microsurgery in Caenorhabditis elegans. Methods Cell Biology. 107, 177-206 (2012).
- Lewis, J. A., et al. Cholinergic Receptor Mutants of the Nematode Caenorhabditis elegans. The Journal of Neuroscience. 7 (10), 3059-3071 (1987).
- Lewis, J. A., Wu, C. H., Berg, H., Levine, J. H. The genetics of levamisole resistance in the nematode Caenorhabditis elegans. Genetics. 95 (4), 905-928 (1980).
- Richmond, J. E., Jorgensen, E. M. One GABA and two acetylcholine receptors function at the C. elegans neuromuscular junction. Nature Neuroscience. 9, 791-798 (1999).
- Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. Long-Term Imaging of Caenorhabditis elegans Using Nanoparticle-Mediated Immobilization. PLoS ONE. 8 (1), 1-6 (2013).
- Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. Computer control of microscopes using umanager. Current Protocols in Molecular Biology. (Suppl 92), 1-17 (2010).
- Richmond, J. Dissecting and Recording from The C. Elegans Neuromuscular Junction. Journal of Visualized Experiments. (24), 1-4 (2009).
- Hoon Cho, J., Bandyopadhyay, J., Lee, J., Park, C. S., Ahnn, J. Two isoforms of sarco/endoplasmic reticulum calcium ATPase (SERCA) are essential in Caenorhabditis elegans. Gene. 261, 211-219 (2000).
- Zwaal, R. R., et al. The Sarco-Endoplasmic Reticulum Ca2+ ATPase Is Required for Development and Muscle Function in Caenorhabditis elegans. The Journal of Biological Chemistry. 276 (47), 43557-43563 (2001).
- Stammers, A. N., et al. The regulation of sarco(endo)plasmic reticulum calcium-ATPases (SERCA). Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 93, 1-12 (2015).
- Clapham, D. E. Calcium Signaling. Cell. 131, 1047-1058 (2007).
- Hovnanian, A. Serca pumps and human diseases. Calcium Signalling and Disease: Molecular Pathology of Calcium. , 337-363 (2007).
- Periasamy, M., Kalyanasundaram, A. SERCA pump isoforms: Their role in calcium transport and disease. Muscle and Nerve. 35 (4), 430-442 (2007).
- Gehlert, S., Bloch, W., Suhr, F. Ca2+-Dependent Regulations and Signaling in Skeletal Muscle: From Electro-Mechanical Coupling to Adaptation. International Journal of Molecular Sciences. 16, 1066-1095 (2015).
- Martin, A. A., Richmond, J. E. The sarco(endo)plasmic reticulum calcium ATPase SCA-1 regulates the Caenorhabditis elegans nicotinic acetylcholine receptor ACR-16. Cell Calcium. 72, 104-115 (2018).
- Wang, Z., Saifee, O., Nonet, M. L., Salkoff, L. SLO-1 Potassium Channels Control Quantal Content of Neurotransmitter Release at the C. elegans Neuromuscular Junction. Neuron. 32, 867-881 (2001).
- Abraham, L. S., Oh, H. J., Sancar, F., Richmond, J. E., Kim, H. An Alpha-Catulin Homologue Controls Neuromuscular Function through Localization of the Dystrophin Complex and BK Channels in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 6 (8), 1-13 (2010).
- Gourgou, E., Chronis, N. Chemically induced oxidative stress affects ASH neuronal function and behavior in C. elegans. Scientific Reports. 6, 1-9 (2016).
- Zahratka, J. A., Williams, P. D. E., Summers, P. J., Komuniecki, R. W., Bamber, B. A. Serotonin differentially modulates Ca2+ transients and depolarization in a C. elegans nociceptor. Journal of Neurophysiology. 113 (4), 1041-1050 (2015).
- Kerr, R., et al. Optical imaging of calcium transients in neurons and pharyngeal muscle of C. elegans. Neuron. 26 (3), 583-594 (2000).
- Nekimken, A. L., et al. Pneumatic stimulation of C. elegans mechanoreceptor neurons in a microfluidic trap. Lab Chip. 17 (6), 1116-1127 (2017).
- Chung, S. H., Sun, L., Gabel, C. V. In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans. Journal of Visualized Experiments. (74), 1-9 (2013).
- Jospin, M., Jacquemond, V., Mariol, M. C., Ségalat, L., Allard, B. The L-type voltage-dependent Ca2+channel EGL-19 controls body wall muscle function in Caenorhabditis elegans. Journal of Cell Biology. 159 (2), 337-347 (2002).
- Wabnig, S., Liewald, J. F., Yu, S., Gottschalk, A. High-Throughput All-Optical Analysis of Synaptic Transmission and Synaptic Vesicle Recycling in Caenorhabditis elegans. PLoS ONE. , 1-26 (2015).
