C.エレガンス体壁筋肉における生体内カルシウムイメージング

本論文では,光遺伝学的神経刺激を用いたC.エレガンス体壁筋の生体内カルシウムイメージングの方法を紹介する.遺伝的にコードされたカルシウム指標(GECI)を青色光で発現した筋肉を組み合わせ、神経脱分極を引き起こし、誘発されたシナプスカルシウム過渡を明確に観察するシステムを提供する。これは電気刺激の使用を避け、後のカルシウムダイナミクスに影響を与える変異体の非侵襲的な分析を可能にする。

GCaMPのような単一蛍光性GECは、そのN末端端部でミオシン軽鎖キナーゼのM13ドメインに融合した単一の蛍光タンパク質分子を使用し、C末端ではカルモジュリン(CaM)を使用する。カルシウム結合時に、カルシウムに対して高い親和性を有するCaMドメインは、蛍光^強度1の増加につながる蛍光タンパク質のその後の立体構造変化を誘発する立体構造変化を受ける。GCaMP蛍光は488nmで励起され、473nmの同様の励起波長を有するチャネルロドプシンと組み合わせて使用することは不適当である。したがって、カルシウム測定値とチャネロドプシン刺激を組み合わせるには、GCaMPの緑色蛍光タンパク質を赤色蛍光タンパク質mRuby(RCaMP)に置き換える必要があります。RCaMPを発現した筋肉を用いて、チャネルロドプシンのコリン作動性運動ニューロン発現と組み合わせて、同じ動物^{内で光遺伝学と機能イメージングを同時に使用するワーム神経筋接合部(NMJ)での研究を可能にする2}.

チャネルロドプシンの使用は、C.エレガンスの神経筋接合部を脱分極するための電気刺激の必要性をバイパスし、解剖製剤でのみ達成できるため、この技術を使用しやすく、より正確に行うことができる。特定の組織を標的にする場合。例えば、チャネルロドプシンは、以前にC.エレガンスで特定のニューロンを可逆的に活性化するために使用され、興奮性または阻害性^{ニューロン3、4}の堅牢な活性化のいずれかにつながる。光刺激脱分極の使用はまた、直接電気刺激による神経損傷の問題を回避する。これは、持続および繰り返し刺激を含む多くの異なる刺激プロトコルが、経例カルシウム^{ダイナミクス4}に及ぼす影響を調べる機会を提供する。

C.エレガンスの透明な性質は蛍光イメージング機能分析にとって理想的である。しかし、NMJで興奮性アセチルコリンニューロンを刺激する場合、動物は即時の筋肉^収縮4で応答することが期待され、離散的なカルシウム変化を視覚化する上でワームの固定化が重要である。伝統的に、薬理学的薬剤は、動物を麻痺させるために使用されてきました。使用されるそのような薬物の1つは、レバミソール、コリン作動性アセチルコリン受容体アゴ^{ニスト5、6、7}である。レバミソールは興奮性筋受容体のサブタイプの持続的な活性化につながるので、この試薬は筋肉カルシウムダイナミクスの研究には不向きである。レバミソールの作用は、シナプス後脱分極、細胞体カルシウムの上昇、およびシナプス前刺激後の観察を遮断する。麻痺薬の使用を避けるために、我々はC.エレガンスを固定する2つの代替方法を検討した。動物を接着し、次いで体壁の筋肉を露出させるために開いて解剖した動物は、既存のC.エレガンスNMJ電気生理学^法8と同様に、またはナノビーズを無傷の^動物9を固定するために使用した。両方の手順は、安静時の再現可能な測定を可能にし、容易に定量化可能な筋肉カルシウム過渡を誘発した。

この論文の方法は、C.エレガンスにおける後体壁筋細胞における基サイトソー酸カルシウムレベルおよび過渡性のベースラインを測定するために使用することができる。2つの異なる固定化技術を用いたデータの例が示される。両方の技術は、電気刺激を使用せずに筋肉細胞を脱分極するために光遺伝学を利用します。これらの例は、ワームにおける後質カルシウム処理に影響を与える変異を評価する際にこの方法の実現可能性を示し、2つの固定化アプローチの長所と短所を指摘する。