In Vivo Calcium Imaging en C. elegans Body Wall Muscles

Este artículo presenta métodos para la toma de imágenes de calcio in vivo de los músculos de la pared corporal de C. elegans utilizando estimulación neuronal optogenética. El emparejamiento de un indicador de calcio codificado genéticamente (GECI) con luz azul desencadenó la despolarización neuronal y proporciona un sistema para observar claramente los transitorios de calcio postsináptico salidados. Esto evita el uso de estimulación eléctrica, permitiendo un análisis no invasivo de mutantes que afectan a la dinámica de calcio postsináptica.

Los GECI de un solo fluoróforo, como GCaMP, utilizan una sola molécula de proteína fluorescente fusionada al dominio M13 de la quinasa de cadena ligera de miosina en su extremo N-terminal y calmodulina (CaM) en el C-terminus. Tras la unión al calcio, el dominio CaM, que tiene una alta afinidad por el calcio, sufre un cambio conformacional que induce un cambio conformacional posterior en la proteína fluorescente que conduce a un aumento en la intensidad de la fluorescencia¹. La fluorescencia GCaMP se excita a 488 nm, por lo que no es adecuado para ser utilizado en combinación con la canalrodilina, que tiene una longitud de onda de excitación similar de 473 nm. Por lo tanto, con el fin de acoplar las mediciones de calcio con la estimulación de la canalroditina, la proteína fluorescente verde de GCaMP debe ser reemplazada por una proteína fluorescente roja, mRuby (RCaMP). El uso del músculo rCaMP expresado, en combinación con la expresión de la neurona motora colinérgica de la canalrodiasina, permite estudios en la unión neuromuscular del gusano (NMJ) con el uso simultáneo de la optogenética y la imagen funcional dentro del mismo animal ².

El uso de la cedrodonina evita la necesidad de la estimulación eléctrica para despolarizar las uniones neuromusculares de C. elegans,lo que sólo se puede lograr en preparaciones diseccionadas, haciendo así esta técnica más fácil de emplear y más precisa cuando se dirige a tejidos específicos. Por ejemplo, channelrhodopsin se ha utilizado previamente en C. elegans para activar de forma reversible neuronas específicas, lo que conduce a la activación robusta de las neuronas excitatorias o inhibitorias^3,4. El uso de la despolarización estimulada por la luz también elude el problema del daño neuronal debido a la estimulación eléctrica directa. Esto proporciona una oportunidad para examinar los efectos de muchos protocolos de estimulación diferentes, incluyendo estimulaciones sostenidas y repetidas, en la dinámica de calcio postsináptica⁴.

La naturaleza transparente de C. elegans lo hace ideal para el análisis funcional de imágenes fluorescentes. Sin embargo, al estimular las neuronas de acetilcolina excitatorias en el NMJ, se espera que los animales respondan con una contracción muscular inmediata^4,haciendo que la inmovilización de los gusanos crítico para visualizar cambios discretos de calcio. Tradicionalmente, se han utilizado agentes farmacológicos para paralizar a los animales. Uno de estos fármacos utilizados es levamisol, un agonista del receptor de acetilcolina colinérgico^5,6,7. Dado que el levamisol conduce a la activación persistente de un subtipo de receptores musculares excitatorios, este reactivo no es adecuado para el estudio de la dinámica muscular de calcio. La acción del levamisol induce la despolarización postsináptica, elevando el calcio citosólico y ocluiendo observaciones después de la estimulación presináptica. Para evitar el uso de medicamentos paralizantes, examinamos dos métodos alternativos para inmovilizar C. elegans. Los animales fueron pegados y luego diseccionados abiertos para exponer los músculos de la pared del cuerpo, similar al método de electrofisiología C. elegans NMJ^{existente 8,}o nanoperlas se utilizaron para inmovilizar animales intactos^9. Ambos procedimientos permitían las mediciones reproducibles del reposo y evocaban transitorios musculares de calcio que eran fácilmente cuantificables.

Los métodos en este artículo se pueden utilizar para medir los niveles basales de calcio citosólico y transitorios en las células musculares de la pared del cuerpo postsináptico en C. elegans. Se proporcionan ejemplos de datos que emplean las dos técnicas de inmovilización diferentes. Ambas técnicas aprovechan la optogenética para despolarizar las células musculares sin el uso de estimulación eléctrica. Estos ejemplos demuestran la viabilidad de este método en la evaluación de mutaciones que afectan el manejo de calcio postsináptico en los gusanos y señalan los pros y los contras de los dos enfoques de inmovilización.