In Vivo Kalsiyum Görüntüleme C. elegans Vücut Duvar Kasları
Summary
Bu yöntem çift optogenetik ve genetik olarak kodlanmış kalsiyum sensörleri görüntü bazal sitosolik kalsiyum düzeyleri ve model organizma C. elegansvücut duvarı kasları uyarılmış kalsiyum geçici değişiklikler için bir yol sağlar.
Abstract
Model organizma C. elegans in vivo kalsiyum görüntüleme gerçekleştirmek için mükemmel bir sistem sağlar. Şeffaf gövdesi ve genetik manipulability genetik olarak kodlanmış kalsiyum sensörleri hedefli ifade sağlar. Bu protokol, hedeflenen hücrelerde kalsiyum dinamiklerinin in vivo görüntüleme için bu sensörlerin kullanımını özetliyor, özellikle solucanların vücut duvarı kasları. Presinaptik kanalrodopsin inko-ekspresyonu kullanılarak, uyarıcı motor nöronlardan asetilkolin salınımının uyarılması mavi ışık darbeleri kullanılarak indüklenebilir, kas depolarizasyonu ve sitoplazmik kalsiyumda tekrarlanabilir değişikliklerle sonuçlanabilir. Düzey. İki solucan immobilizasyon teknikleri zorluk değişen düzeylerde tartışılmıştır. Bu tekniklerin karşılaştırılması, her iki yaklaşımın da nöromüsküler kavşak fizyolojisini koruduğunu ve kalsiyum geçicilerinin tekrarlanabilir nicelifikasyonuna olanak sağladığını göstermektedir. Optogenetik ve fonksiyonel kalsiyum görüntüleme ile postsinaptik kalsiyum kullanımı ve homeostazdaki değişiklikler çeşitli mutant arka planlarda değerlendirilebilir. Sunulan veriler hem immobilizasyon tekniklerini doğrular hem de özellikle C. elegans sarco(endo)plazmik retiküler kalsiyum ATPaz ve vücut duvarı kas kalsiyum regülasyonundaki kalsiyum aktive Edilmiş BK potasyum kanalının rollerini inceler.
Introduction
Bu yazıda optogenetik nöronal stimülasyon kullanarak C. elegans vücut duvarı kaslarının in vivo kalsiyum görüntüleme yöntemleri sunmaktadır. Genetik olarak kodlanmış kalsiyum indikatörü (GECI) ile mavi ışık la eşleşen bir kasın eşleşmesi nöronal depolarizasyonu tetikler ve uyarılmış postsinaptik kalsiyum geçicilerini net bir şekilde gözlemleyen bir sistem sağlar. Bu, postinaptik kalsiyum dinamiklerini etkileyen mutantların non-invaziv analizini sağlayarak elektriksel stimülasyonkullanımını önler.
GCaMP gibi tek floroforem GECIs, C-terminus’ta n-terminal ucunda ve calmodulin (CaM) miyozin ışık zinciri kimyazının M13 etki alanına erimiş tek bir floresan protein molekülü kullanır. Kalsiyum bağlanması üzerine, kalsiyum afiniteyüksek olan CaM etki alanı, floresan protein sonraki konformasyonel değişim indükleyen bir konformasyonel değişim uğrarfloresanyoğunluğu nda bir artışa yol açan 1 . GCaMP floresan 488 nm heyecanlı, channelrhodopsin ile birlikte kullanılmak üzere uygun hale, hangi benzer bir uyarma dalga boyu vardır 473 nm. Bu nedenle, kalsiyum ölçümlerini kanaloidsin stimülasyonu ile çifte ayırmak için, GCaMP’ın yeşil floresan proteininin kırmızı floresan proteini mRuby (RCaMP) ile değiştirilmesi gerekir. Kas ifade RCaMP kullanarak, channelrhodopsin kolinerjik motor nöron ekspresyonu ile birlikte, aynı hayvan içinde optogenetik ve fonksiyonel görüntüleme eşzamanlı kullanımı ile solucan nöromüsküler kavşak (NMJ) çalışmaları izin verir 2 .
Channelrhodopsin kullanımı C. elegansnöromüsküler kavşaklar depolarize etmek için elektrikstimülasyon ihtiyacını atlar , sadece diseksiyon preparatları elde edilebilir, böylece bu tekniği hem daha kolay istihdam ve daha hassas hale belirli dokuları hedef alırken. Örneğin, channelrhodopsin daha önce C. elegans geri belirli nöronları etkinleştirmek için kullanılmıştır, uyarıcı veya inhibitör nöronların ya sağlam aktivasyonu yolaçan 3,4. Işık uyarılmış depolarizasyon kullanımı da doğrudan elektriksel stimülasyon nedeniyle nöronal hasar sorunu atlatMaktadır. Bu postsinaptik kalsiyumdinamikleri4, sürekli ve tekrarlanan stimülasyonlar da dahil olmak üzere birçok farklı stimülasyon protokolleri, etkilerini incelemek için bir fırsat sağlar.
C. elegans şeffaf doğası floresan görüntüleme fonksiyonel analiz için ideal hale getirir. Ancak, NMJ de uyarıcı asetilkolin nöronlar uyarıcı, hayvanların ani bir kas kasılması ile yanıt bekleniyor4, ayrık kalsiyum değişiklikleri görselleştirme solucanların immobilizasyon kritik hale. Geleneksel olarak, farmakolojik ajanlar hayvanları felç etmek için kullanılmıştır. Kullanılan böyle bir ilaç levamisole, bir kolinerjik asetilkolin reseptör agonist5,6,7. Levamisole uyarıcı kas reseptörlerinin bir alt tipinin kalıcı aktivasyonuna yol açtığından, bu reaktif kas kalsiyum dinamiğinin incelenmesi için uygun değildir. Levamisole eylem postsinaptik depolarizasyon neden olur, sitosolik kalsiyum yükselterek, ve presinaptik stimülasyon aşağıdaki gözlemler oklüt. Felç edici ilaçların kullanılmasını önlemek için C. elegans’ıetkisiz hale getirmek için iki alternatif yöntem irdeledik. Hayvanlar ya yapıştırılmış ve daha sonra vücut duvar kasları ortaya çıkarmak için açık, mevcut C. elegans NMJ elektrofizyoloji yöntemi8benzer, ya da nanoboncuklar bozulmamış hayvanları hareketsiz leştirmek için kullanılmıştır9. Her iki prosedür kolayca ölçülebilir olan istirahat ve uyarılmış kas kalsiyum geçici tekrarlanabilir ölçümler için izin verdi.
Bu yazıda yöntemler Temel sitosolik kalsiyum düzeyleri ve Geçici olarak m. eleganspostsinaptik vücut duvarı kas hücrelerinde ölçmek için kullanılabilir. İki farklı immobilizasyon tekniğini kullanan veri örnekleri verilmiştir. Her iki teknik elektriksel stimülasyon kullanmadan kas hücrelerini depolarize etmek için optogenetik yararlanmak. Bu örnekler, solucanlarda postinaptik kalsiyum kullanımını etkileyen mutasyonların değerlendirilmesinde bu yöntemin fizibilitesini göstermekte ve iki immobilizasyon yaklaşımının artılarını ve eksilerini göstermektedir.
Protocol
Representative Results
Discussion
GECIs C. elegans nörobiyoloji güçlü bir araçtır. Önceki çalışmalarda, duyusal ve davranışsal tepkiler de dahil olmak üzere, hem nöronlarda hem de kas hücrelerinde çeşitli fonksiyonlar ve çeşitli stimülasyon yöntemleri ile incelemek için kalsiyum görüntüleme teknikleri kullanılmıştır. Bazı çalışmalar da duyusal ASH nöronlarda kalsiyum geçici tetiklemek için kimyasal uyaranlar kullandık22,23 veya faringeal kaslarda kals…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar ZX1659 için Dr Alexander Gottschalk teşekkür, RCaMP ve kanalrhodopsin solucan suşu içeren, Dr Hongkyun Kim slo-1 (örneğin142) solucan suşu için, ve Sca-1 (tm5339) solucan suşu için Ulusal Biyokaynak Projesi.
Materials
| all-trans retinal | Sigma-Aldrich | R2500 | Necessary for excitation of channel rhodopsin |
| Amber LED | RCaMP illumination | ||
| Arduino UNO | Mouser | 782-A000066 | Controls fluorescence illumination |
| Blue LED | channelrhodopsin illumination | ||
| BX51WI microscope | Olympus | Fixed state compound microscope | |
| Current controlled low noise linear power supply | Ametek | Sorenson | Controls LED intensity |
| Igor Pro | Wavemetrics | Wavemetrics.com | Graphing software |
| ImageJ | NIH | imagej.nih.gov | Image processing software |
| LUMFLN 60x water NA 1.4 | Olympus | Water immersion objective for dissected preparation | |
| Master-8 Stimulator | A.M.P.I | Master timer for image acquisition and LED illumination | |
| Micro-Manager | micro-manager.org | Controls camera acquisition and LED excitiation | |
| Microsoft Excel | Microsoft | Spreadsheet software | |
| pco.edge 4.2 CMOS camera | pco. | 4.2 | High-speed camera |
| PlanApo N 60x oil NA 1.4 | Olympus | Oil immersion objective for nanobead preparation | |
| Polybead microspheres | Polysciences, Inc. | 00876-15 | For worm immobilization |
| solid state switches | Sensata Technologies | Crydom CMX100D6 | Controls timing of LED illumination |
| Transgenic strain, sca-1(tm5339); [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35] |
Richmond Lab | SY1627 | Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line with SERCA mutant allele |
| Transgenic strain, slo-1 (eg142); [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35] |
Richmond Lab | Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line with calcium-activated BK potassium channel mutant allele | |
| Transgeneic strain, [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35] |
Gottschalk Lab | ZX1659 | Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line |
References
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca2+ probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
- Akerboom, J., et al. Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics. Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 1-29 (2013).
- Nagel, G., et al. Light Activation of Channelrhodopsin-2 in Excitable Cells of Caenorhabditis elegans Triggers Rapid Behavioral Responses. Current Biology. 15 (24), 2279-2284 (2005).
- Liewald, J. F., et al. Optogenetic analysis of synaptic function. Nature Methods. 5 (10), 895-902 (2008).
- Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D. T., Bargmann, C. I., Avery, L. Laser Microsurgery in Caenorhabditis elegans. Methods Cell Biology. 107, 177-206 (2012).
- Lewis, J. A., et al. Cholinergic Receptor Mutants of the Nematode Caenorhabditis elegans. The Journal of Neuroscience. 7 (10), 3059-3071 (1987).
- Lewis, J. A., Wu, C. H., Berg, H., Levine, J. H. The genetics of levamisole resistance in the nematode Caenorhabditis elegans. Genetics. 95 (4), 905-928 (1980).
- Richmond, J. E., Jorgensen, E. M. One GABA and two acetylcholine receptors function at the C. elegans neuromuscular junction. Nature Neuroscience. 9, 791-798 (1999).
- Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. Long-Term Imaging of Caenorhabditis elegans Using Nanoparticle-Mediated Immobilization. PLoS ONE. 8 (1), 1-6 (2013).
- Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. Computer control of microscopes using umanager. Current Protocols in Molecular Biology. (Suppl 92), 1-17 (2010).
- Richmond, J. Dissecting and Recording from The C. Elegans Neuromuscular Junction. Journal of Visualized Experiments. (24), 1-4 (2009).
- Hoon Cho, J., Bandyopadhyay, J., Lee, J., Park, C. S., Ahnn, J. Two isoforms of sarco/endoplasmic reticulum calcium ATPase (SERCA) are essential in Caenorhabditis elegans. Gene. 261, 211-219 (2000).
- Zwaal, R. R., et al. The Sarco-Endoplasmic Reticulum Ca2+ ATPase Is Required for Development and Muscle Function in Caenorhabditis elegans. The Journal of Biological Chemistry. 276 (47), 43557-43563 (2001).
- Stammers, A. N., et al. The regulation of sarco(endo)plasmic reticulum calcium-ATPases (SERCA). Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 93, 1-12 (2015).
- Clapham, D. E. Calcium Signaling. Cell. 131, 1047-1058 (2007).
- Hovnanian, A. Serca pumps and human diseases. Calcium Signalling and Disease: Molecular Pathology of Calcium. , 337-363 (2007).
- Periasamy, M., Kalyanasundaram, A. SERCA pump isoforms: Their role in calcium transport and disease. Muscle and Nerve. 35 (4), 430-442 (2007).
- Gehlert, S., Bloch, W., Suhr, F. Ca2+-Dependent Regulations and Signaling in Skeletal Muscle: From Electro-Mechanical Coupling to Adaptation. International Journal of Molecular Sciences. 16, 1066-1095 (2015).
- Martin, A. A., Richmond, J. E. The sarco(endo)plasmic reticulum calcium ATPase SCA-1 regulates the Caenorhabditis elegans nicotinic acetylcholine receptor ACR-16. Cell Calcium. 72, 104-115 (2018).
- Wang, Z., Saifee, O., Nonet, M. L., Salkoff, L. SLO-1 Potassium Channels Control Quantal Content of Neurotransmitter Release at the C. elegans Neuromuscular Junction. Neuron. 32, 867-881 (2001).
- Abraham, L. S., Oh, H. J., Sancar, F., Richmond, J. E., Kim, H. An Alpha-Catulin Homologue Controls Neuromuscular Function through Localization of the Dystrophin Complex and BK Channels in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 6 (8), 1-13 (2010).
- Gourgou, E., Chronis, N. Chemically induced oxidative stress affects ASH neuronal function and behavior in C. elegans. Scientific Reports. 6, 1-9 (2016).
- Zahratka, J. A., Williams, P. D. E., Summers, P. J., Komuniecki, R. W., Bamber, B. A. Serotonin differentially modulates Ca2+ transients and depolarization in a C. elegans nociceptor. Journal of Neurophysiology. 113 (4), 1041-1050 (2015).
- Kerr, R., et al. Optical imaging of calcium transients in neurons and pharyngeal muscle of C. elegans. Neuron. 26 (3), 583-594 (2000).
- Nekimken, A. L., et al. Pneumatic stimulation of C. elegans mechanoreceptor neurons in a microfluidic trap. Lab Chip. 17 (6), 1116-1127 (2017).
- Chung, S. H., Sun, L., Gabel, C. V. In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans. Journal of Visualized Experiments. (74), 1-9 (2013).
- Jospin, M., Jacquemond, V., Mariol, M. C., Ségalat, L., Allard, B. The L-type voltage-dependent Ca2+channel EGL-19 controls body wall muscle function in Caenorhabditis elegans. Journal of Cell Biology. 159 (2), 337-347 (2002).
- Wabnig, S., Liewald, J. F., Yu, S., Gottschalk, A. High-Throughput All-Optical Analysis of Synaptic Transmission and Synaptic Vesicle Recycling in Caenorhabditis elegans. PLoS ONE. , 1-26 (2015).
