感染した組織の細菌の遺伝子の規則を勉強する蛍光ベースのメソッド
Summary
ここで説明は、動物組織細胞レベルでの細菌の遺伝子発現解析の方法です。このメソッドは、組織環境への応答で感染症に細菌の人口の内で発生する表現型の多様性を研究するためのリソースを提供します。
Abstract
細菌の病原性遺伝子は多くの場合転写レベルで異なる環境シグナルに応答する複数の要因によって調整されます。いくつかの要因は病原性遺伝子に直接作用します。他の人は下流のレギュレータの式やレギュレータの活動に影響を与える信号の蓄積を調整することによって病態を制御します。規制は、生体外で成長中広く研究されている、しながら比較的感染時に遺伝子発現を調整する方法について少し知られています。そのような情報は、特定の遺伝子産物の治療的介入の候補であるときに重要です。転写のアプローチのように量的なリアルタイム RT-PCR 法と RNA シーケンスは、グローバル レベルでの遺伝子発現を調べるが、ホストの RNA とサンプルと比較して細菌の RNA の低い豊富を含む多くの技術的な課題に苦しむの強力な方法RNases による劣化。蛍光レポーターを使用して規制の評価は比較的簡単とユニークな波長特性を持つ蛍光タンパク質を用いた多重することができます。メソッドは、単一セル、時空間細菌制御ネットワークに影響を与える複雑な三次元アーキテクチャと物理化学的勾配を示す組織における遺伝子発現解析のためことができます。データは一括人口平均化と、このような情報は失われます。ここで、細菌性病原体の場で遺伝子の発現を定量化するための手法について述べる。メソッドは、単純なティッシュの処理と蛍光レポーター蛋白質からの直接観察に基づいています。黄色ブドウ球菌thermonuclease (nuc)、その遺伝子産物は免疫回避と ex vivo および in vivo における病原性に必要な発現を調べることによってこのシステムの有用性を示す.そのnuc gfpは強く腎膿瘍で表され、免疫応答による完全に従事して膿瘍におけるnucプロモーター活性の明白な空間規制の一部による異種遺伝子発現を明らかに示します。このメソッドは、操作可能な遺伝的システムに任意の細菌および前臨床研究と医薬品開発のための貴重な情報を提供する、任意の感染モデルに適用できます。
Introduction
細菌は、適応や生存に必要な遺伝子の差動表現で生理学的な条件と環境の栄養状態の変化の変化に対応します。例えば、日和見病原体には、ボディ表面は比較的低密度で無害なことが多いが植民地化します。ただし、細菌には、物理的・化学的障壁が浸透して、一度、ホスト免疫細胞カウンター防御と栄養アベイラビリティの制限1主張する必要があります。例として、黄色ブドウ球菌性感の人口の約 3 分の 1 の定着が、壊滅的な皮膚および軟部組織感染症、骨髄炎、心内膜炎、菌血症と2の原因でもあります。黄色ブドウ球菌の病原体としての成功は、その代謝の柔軟性だけでなく、細菌を血流を脱出し、末梢組織の複製を有効にする表面関連と分泌の病原因子の武器といわれる3,4,5。ブドウ球菌性疾患によるホスト死は進化の行き止まりと新しいホスト6伝送が制限、病原性因子産生へのコミットメントを慎重に制御する必要があります。
非コーディング RNAs 反応する様々 な環境刺激とタンパク質の複雑な規制のネットワークを含む細胞密度、成長期、好中球関連要因と養分可用性、病原性遺伝子がで表されることを確保するため、正確な時間、ホスト組織7,8,9,10、11,12,13内の場所。例えば、サエル/S の 2 つのコンポーネント システム (TCS) は、センサー キナーゼ (サエス) と応答レギュレータ (サエル)14を介していくつかの病原因子の発現を調節します。サエスはホスト信号 (例,ひと好中球ペプチド [HNPs] カルプロテクチン)8,,1516レスポンスで節約されたヒスチジン残基の自己です。サエル、DNA 結合タンパク質としてそれをアクティブにするのにはアスパラギン酸残基にリン酸化グループ、転送されます (サエル ~ P)17。サエル/S TCS は、フィブロネクチン結合蛋白質 (FnBPs)、leukocidins、コアグラーゼ14,18,,1920など病態に寄与する 20 以上の遺伝子を調節します。サエルのレベルとして誘導の可能性がある高親和性・低親和性遺伝子ターゲットにターゲットを分類できます 〜 P 上昇その手がかり21に露出されたとき。サエル/S の活動は、Agr クォーラム センシング システムなど遺伝子発現の他の規制当局、毒素タンパク質 (Rot) と代替シグマ因子 B (SigB)22,23,24のリプレッサーによって制御されます。
nucの黄色ブドウ球菌の Sae 依存病原性遺伝子、 neutrophilic extracellular trap (ネット) から脱出するため、中に普及のために不可欠である thermonuclease (Nuc) をエンコード、感染25,26のコースです。Nucの式を分岐鎖アミノ酸と GTP27, 存在下でコーディでも強く直接に抑圧し、ブドウ球菌アクセサリー調節蛋白質サラ28,29 によって直接抑圧、その活動は、酸素 (酸化還元状態) と pH30によって影響されます。Sae 、 nucの変異体は、感染症のマウスモデルの減衰は、ことを考える彼らの対応する活動26,31を阻害する化学の介入の開発に関心があります。それにもかかわらず、感染時の規制に関する情報はありません。
蛍光レポーターは、監視し、単一細胞レベルでの遺伝子の発現を定量化する使用されています。ここで、 Sの定量化手法を提案します。黄色ブドウ球菌感染症に発現する遺伝子と組み合わせればin vitro におけるトランスクリプトーム解析と磁気共鳴画像 (MRI) や磁気共鳴分光法 (MRS) のような強力なイメージング技術を明らかにすることができますどのように細菌生理学は、特定のニッチで栄養素の相対的な存在量で規制されています。メソッドは、扱いやすい遺伝的システムと細菌の病原体に適用できます。
ゲノムの統合的なベクトルの概要です。
ゲノム統合のベクトル pRB4 には、各相同組換えを促進する黄色ブドウ球菌usa 300 SAUSA300_0087偽遺伝子の上流と下流地域から 500 の塩基対が含まれています。pRB4 は、耐熱性 β-ガラクトシダーゼ遺伝子ガラクトシダーゼ組み換え32の青/白のスクリーニングのためのエリスロマイシン耐性カセット (ermC) を含む温度敏感な pMAD ベクター バックボーンから派生されます。設計された記者コンストラクトでは、ゲノム統合プラスミド除去と superfolder グリーンに関心の規制地域をヒューズに EcoRI および SmaI サイト後選択のクロラムフェニ コール耐性マーカー (猫) も含まれています蛍光タンパク質 (sGFP) (図 1)。それは、リボソーム結合部位 (RBS) の選択が、レポーターの活動に影響を与える多くの場合経験的最適化33を必要とする知られています。したがって、RBS は付属されていません。ここでは、ネイティブ リボゾームの結合サイトは遺伝子発現のより自然なパターンを提供するために使用されるが、他のサイトを使用することがあります。
Protocol
Representative Results
Discussion
細菌感染症は、抗生の抵抗の決定要因の46の取得により世界的な増加する健康問題です。ホスト環境への適応は成長と感染中の生存に不可欠な病原体のフィットネスを高める遺伝子発現プログラムを見据えた戦略は治療役に立つかもしれない。1 つのようなプログラムは、サエル/S 2 つコンポーネント システム (TCS)、免疫回避47で重要な役割を再生する前に?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
フローサイトメトリー解析ヘルプについては PsarAP1– tdTomato 融合とカレン クレスウェルの贈り物ありがとうアレキサンダー Horswill。我々 はまた統計的な分析でアドバイスをアリッサ王をありがちましょう。この作品は、NIH 萌芽/発達研究賞 (グラント AI123708) と SRB 学部スタートアップ資金によって一部で賄われていた。資金提供者には、研究デザイン、データの収集と解釈、または出版物のための仕事を提出する決定の役割はなかった。
Materials
| 5% sheep blood | Hardy Diagnostics (Santa Maria, CA) | A10 | |
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal) | ThermoScientific | R0402 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-25 | |
| C57Bl/6 Mice | Charles River | NA | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C-0378 | |
| confocal laser scanning microscope | Zeiss | NA | |
| cryostat microtome | Thermo Scientific | NA | |
| Culture, Cap | VWR International | 2005-02512 | |
| D+2:25NA Oligo | Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa) | NA | |
| DNA Ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| Erythromycin | Sigma-Aldrich | E5389 | |
| Flow Analyzer | Becton Dickinson | NA | |
| glass beads | Sigma | Z273627 | |
| Miniprep, plasmid | Promega | A1220 | |
| orbital shaking water bath | New Brunswick Innova | NA | |
| PCR purification | QIagen | 28106 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Cellgrow | 46-013-CM | |
| Plate reader | Tecan | NA | |
| Precellys 24 homogenizer | Bertin Laboratories | NA | |
| pUC57-Kan | GenScript (Piscataway, NJ) | NA | |
| Q5 Taq DNA Polymerase | New England Biolabs (Ipswich, MA) | M0491S | |
| Restriction Enzymes | New England Biolabs (Ipswich, MA) | R0150S (PvuI), R3136S (BamHI), R0144S (BglII), R3131S (NheI), R0101S (EcoRI), R0141S (SmaI). | |
| Reverse transcriptase | New England BioLabs | E6300L | |
| Sanger Sequencing | Genewiz (Germantown, MD) | NA | |
| Sub Xero clear tissue freezing medium | Mercedes Medical | MER5000 | |
| Superfrost Plus microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| superloop | GE Lifesciences | 18111382 | |
| Syringe, Filter | VWR International | 28145-481 | |
| Syto 40 | Thermo Fisher Scientific | S11351 | Membrane permeant nucleic acid stain |
| Tetracycline | Sigma-Aldrich | T7660 | |
| Tryptic Soy Broth | VWR | 90000-376 | |
| UV-visible spectrophotometer | Beckman Coulter-DU350 | NA | |
| Vectashield Antifade Mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 |
References
- Hood, M. I., Skaar, E. P. Nutritional immunity: transition metals at the pathogen-host interface. Nature Reviews Microbiology. 10 (8), 525-537 (2012).
- Lowy, F. Staphylococcus aureus infections. The New England Journal of Medicine. 339 (8), 520-532 (1998).
- Grosser, M. R., et al. Genetic requirements for Staphylococcus aureus nitric oxide resistance and virulence. PLoS Pathogen. 14 (3), 1006907 (2018).
- Valentino, M., et al. Genes contributing to Staphylococcus aureus fitness in abscess- and infection-related ecologies. MBio. 5 (5), 01714-01729 (2014).
- Cheng, A., et al. Genetic requirements for Staphylococcus aureus abscess formation and persistence in host tissues. FASEB Journal. 23 (10), 3393-3404 (2009).
- Meyers, L. A., Levin, B. R., Richardson, A. R., Stojiljkovic, I. Epidemiology, hypermutation, within-host evolution and the virulence of Neisseria meningitidis. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 270 (1525), 1667-1677 (2003).
- Balasubramanian, D., et al. Staphylococcus aureus Coordinates Leukocidin Expression and Pathogenesis by Sensing Metabolic Fluxes via RpiRc. MBio. 7 (3), 00818 (2016).
- Geiger, T., Goerke, C., Mainiero, M., Kraus, D., Wolz, C. The virulence regulator Sae of Staphylococcus aureus.: promoter activities and response to phagocytosis-related signals. Journal of Bacteriology. 190 (10), 3419-3428 (2008).
- Weiss, A., Broach, W. H., Shaw, L. N. Characterizing the transcriptional adaptation of Staphylococcus aureus. to stationary phase growth. Pathogens and Disease. 74 (5), (2016).
- Balaban, N., Novick, R. P. Autocrine regulation of toxin synthesis by Staphylococcus aureus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (5), 1619-1623 (1995).
- Pohl, K., et al. CodY in Staphylococcus aureus: a regulatory link between metabolism and virulence gene expression. Journal of Bacteriology. 191 (9), 2953-2963 (2009).
- Majerczyk, C. D., et al. Staphylococcus aureus CodY negatively regulates virulence gene expression. Journal of Bacteriology. 190 (7), 2257-2265 (2008).
- McNamara, P. J., Milligan-Monroe, K. C., Khalili, S., Proctor, R. A. Identification, cloning, and initial characterization of rot, a locus encoding a regulator of virulence factor expression in Staphylococcus aureus. Journal of Bacteriology. 182 (11), 3197-3203 (2000).
- Liu, Q., Yeo, W. S., Bae, T. The SaeRS Two-Component System of Staphylococcus aureus. Genes (Basel). 7 (10), 81 (2016).
- Giraudo, A., Calzolari, A., Cataldi, A., Bogni, C., Nagel, R. The sae locus of Staphylococcus aureus encodes a two-component regulatory system. FEMS Microbiology Letters. 177 (1), 15-22 (1999).
- Cho, H., et al. Calprotectin Increases the Activity of the SaeRS Two Component System and Murine Mortality during Staphylococcus aureus Infections. PLoS Pathogen. 11 (7), 1005026 (2015).
- Sun, F., et al. In the Staphylococcus aureus two-component system sae, the response regulator SaeR binds to a direct repeat sequence and DNA binding requires phosphorylation by the sensor kinase SaeS. Journal of Bacteriology. 192 (8), 2111-2127 (2010).
- Liang, X., et al. Inactivation of a two-component signal transduction system, SaeRS, eliminates adherence and attenuates virulence of Staphylococcus aureus. Infection and Immunity. 74 (8), 4655-4665 (2006).
- Giraudo, A. T., Cheung, A. L., Nagel, R. The sae locus of Staphylococcus aureus controls exoprotein synthesis at the transcriptional level. Archives of Microbiology. 168 (1), 53-58 (1997).
- Flack, C. E., et al. Differential regulation of staphylococcal virulence by the sensor kinase SaeS in response to neutrophil-derived stimuli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (19), 2037-2045 (2014).
- Mainiero, M., et al. Differential target gene activation by the Staphylococcus aureus two-component system saeRS. Journal of Bacteriology. 192 (3), 613-623 (2010).
- Li, D., Cheung, A. Repression of hla by rot is dependent on sae in Staphylococcus aureus. Infection and Immunity. 76 (3), 1068-1075 (2008).
- Bischoff, M., et al. Microarray-based analysis of the Staphylococcus aureus sigmaB regulon. Journal of Bacteriology. 186 (13), 4085-4099 (2004).
- Novick, R., Jiang, D. The staphylococcal saeRS system coordinates environmental signals with agr quorum sensing. Microbiology. 149, 2709-2717 (2003).
- Olson, M. E., et al. Staphylococcus aureus nuclease is an SaeRS-dependent virulence factor. Infection and Immunity. 81 (4), 1316-1324 (2013).
- Berends, E., et al. Nuclease expression by Staphylococcus aureus facilitates escape from neutrophil extracellular traps. Journal of Innate Immunity. 2 (6), 576-587 (2010).
- Waters, N. R., et al. A spectrum of CodY activities drives metabolic reorganization and virulence gene expression in Staphylococcus aureus. Molecular Microbiology. 101 (3), 495-514 (2016).
- Cassat, J., et al. Transcriptional profiling of a Staphylococcus aureus clinical isolate and its isogenic agr and sarA mutants reveals global differences in comparison to the laboratory strain RN6390. Microbiology. 152, 3075-3090 (2006).
- Kiedrowski, M., et al. Nuclease modulates biofilm formation in community-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus. PLoS One. 6 (11), 26714 (2011).
- Fujimoto, D. F., et al. Staphylococcus aureus SarA is a regulatory protein responsive to redox and pH that can support bacteriophage lambda integrase-mediated excision/recombination. Molecular Microbiology. 74 (6), 1445-1458 (2009).
- Yeo, W. S., et al. The FDA-approved anti-cancer drugs, streptozotocin and floxuridine, reduce the virulence of Staphylococcus aureus. Scientific Reports. 8 (1), 2521 (2018).
- Arnaud, M., Chastanet, A., Débarbouillé, M. New vector for efficient allelic replacement in naturally nontransformable, low-GC-content, Gram-positive bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 70 (11), 6887-6891 (2004).
- Malone, C. L., et al. Fluorescent reporters for Staphylococcus aureus. Journal of Microbiological Methods. 77 (3), 251-260 (2009).
- Schenk, S., Laddaga, R. A. Improved method for electroporation of Staphylococcus aureus. FEMS Microbiology Letters. 73 (1-2), 133-138 (1992).
- Monk, I. R., Foster, T. J. Genetic manipulation of Staphylococci-breaking through the barrier. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 2, 49 (2012).
- Novick, R. P. Genetic systems in staphylococci. Methods in Enzymology. 204, 587-636 (1991).
- Diep, B. A., et al. Complete genome sequence of USA300, an epidemic clone of community-acquired meticillin-resistant Staphylococcus aureus. Lancet. 367 (9512), 731-739 (2006).
- Boles, B. R., Thoendel, M., Roth, A. J., Horswill, A. R. Identification of genes involved in polysaccharide-independent Staphylococcus aureus biofilm formation. PLoS One. 5 (4), 10146 (2010).
- Villaruz, A. E., et al. A point mutation in the agr locus rather than expression of the Panton-Valentine leukocidin caused previously reported phenotypes in Staphylococcus aureus pneumonia and gene regulation. Journal of Infect Diseases. 200 (5), 724-734 (2009).
- Reeves, P. G., Nielsen, F. H., Fahey, G. C. J. AIN-93 purified diets for laboratory rodents: final report of the American Institute of Nutrition ad hoc writing committee on the reformulation of the AIN-76A rodent diet. Journal of Nutrition. 123 (11), 1939-1951 (1993).
- Thomer, L., Schneewind, O., Missiakas, D. Pathogenesis of Staphylococcus aureus Bloodstream Infections. Annual Review of Pathology. 11, 343-364 (2016).
- Olson, M., et al. Staphylococcus aureus nuclease is an SaeRS-dependent virulence factor. Infection and Immunity. 81 (4), 1316-1324 (2013).
- Thammavongsa, V., Missiakas, D., Schneewind, O. Staphylococcus aureus degrades neutrophil extracellular traps to promote immune cell death. Science. 342 (6160), 863-866 (2013).
- Cheung, A. L., Nast, C. C., Bayer, A. S. Selective activation of sar promoters with the use of green fluorescent protein transcriptional fusions as the detection system in the rabbit endocarditis model. Infection and Immunity. 66 (12), 5988-5993 (1998).
- Pilsczek, F. H., et al. A novel mechanism of rapid nuclear neutrophil extracellular trap formation in response to Staphylococcus aureus. Journal of Immunology. 185 (12), 7413-7425 (2010).
- Uhlemann, A. C., Otto, M., Lowy, F. D., DeLeo, F. R. Evolution of community- and healthcare-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Infection, Genetics and Evolution. 21, 563-574 (2014).
- Voyich, J. M., et al. The SaeR/S gene regulatory system is essential for innate immune evasion by Staphylococcus aureus. Journal of Infectious Diseases. 199 (11), 1698-1706 (2009).
- Cheng, A., DeDent, A., Schneewind, O., Missiakas, D. A play in four acts: Staphylococcus aureus. abscess formation. Trends in Microbiology. 19 (5), 225-232 (2011).
- Balasubramanian, D., Harper, L., Shopsin, B., Torres, V. J. Staphylococcus aureus pathogenesis in diverse host environments. Pathogens and Disease. 75 (1), (2017).
- Vitko, N. P., Grosser, M. R., Khatri, D., Thurlow, L. R., Richardson, A. R. Expanded Glucose Import Capability Affords Staphylococcus aureus Optimized Glycolytic Flux during Infection. MBio. 7 (3), 00296 (2016).
- Landete, J. M., et al. Use of anaerobic green fluorescent protein versus green fluorescent protein as reporter in lactic acid bacteria. Applied Microbiology and Biotechnol. 99 (16), 6865-6877 (2015).
- Buckley, A. M., et al. Lighting Up Clostridium Difficile: Reporting Gene Expression Using Fluorescent Lov Domains. Scientific Reports. 6, 23463 (2016).
- Bose, J. L. Genetic manipulation of staphylococci. Methods in Molecular Biology. 1106, 101-111 (2014).
- Krute, C. N., et al. Generation of a stable plasmid for in vitro and in vivo studies of Staphylococcus. Applied and Environmental Microbiology. , 02370 (2016).
- Cassat, J. E., et al. Integrated molecular imaging reveals tissue heterogeneity driving host-pathogen interactions. Science Translational Medicine. 10 (432), 6361 (2018).
- Handlogten, M. E., Hong, S. P., Westhoff, C. M., Weiner, I. D. Apical ammonia transport by the mouse inner medullary collecting duct cell (mIMCD-3). American Journal of Physiology-Renal Physiology. 289 (2), 347-358 (2005).
- Hijmans, B. S., Grefhorst, A., Oosterveer, M. H., Groen, A. K. Zonation of glucose and fatty acid metabolism in the liver: mechanism and metabolic consequences. Biochimie Journal. 96, 121-129 (2014).
- Davis, K. M., Mohammadi, S., Isberg, R. R. Community behavior and spatial regulation within a bacterial microcolony in deep tissue sites serves to protect against host attack. Cell Host & Microbe. 17 (1), 21-31 (2015).
- Stenman, J. M., et al. Canonical Wnt signaling regulates organ-specific assembly and differentiation of CNS vasculature. Science. 322 (5905), 1247-1250 (2008).
