Une méthode axée sur la Fluorescence pour étudier la régulation des gènes bactériens dans les tissus infectés

Bactéries répondent à l’évolution des conditions physiologiques et les modifications de l’état nutritionnel de leur environnement de façon différentielle exprimant des gènes nécessaires à l’adaptation et la survie. Par exemple, des agents pathogènes opportunistes colonisent les corps des surfaces à relativement faible densité et sont souvent inoffensifs. Cependant, une fois que la bactérie a pénétré les barrières physiques et chimiques, il doit composer avec Counter-défenses des cellules immunitaires de l’hôte et de la disponibilité restreinte des nutriments¹. À titre d’exemple, Staphylococcus aureus colonise environ le tiers de la population de façon asymptomatique, mais est également la cause de dévastateur de la peau et des tissus mous, ostéomyélite, endocardite et bactériémie². Le succès S. aureus comme un pathogène est souvent attribué à sa flexibilité métabolique, mais aussi un arsenal de facteurs de virulence de surface associées et sécrétées qui permettent à la bactérie d’échapper à la circulation sanguine et se répliquer dans les tissus périphériques ^3,4,5. Parce que l’hôte mort due à une maladie staphylococcique est une impasse évolutive et la transmission de limites aux nouveaux hôtes⁶, l’engagement à la production de facteur de virulence doit être soigneusement contrôlée.

Un réseau complexe de réglementation des protéines et répond d’ARN non codants à une variété de stimuli environnementaux, y compris de cellules densité, phase de croissance, facteurs associés à neutrophile et disponibilité des nutriments, pour s’assurer que les gènes de virulence sont exprimées à la heure exacte et l’emplacement au sein de l’hôte tissus^{7,8,9,10,11,12,13}. Par exemple, le système à deux composants SaeR/S (TCS) régule l’expression de plusieurs facteurs de virulence par la kinase de capteur (SaeS) et la réponse régulateur (SaeR)¹⁴. SaeS est autophosphorylated sur un résidu histidine conservée en réponse à l’hôte des signaux (par exemple, human neutrophiles peptides [HNPs], calprotectine)^8,15,16. Le groupe phosphoryle est ensuite transféré dans un résidu aspartate sur SaeR, activant ce dernier comme une protéine de liaison à l’ADN (SaeR ~ P)¹⁷. Le SDC SaeR/S réglemente plus de 20 gènes qui contribuent à la pathogénèse, y compris les protéines de liaison de la fibronectine (FnBPs), leukocidins et staphylocoques à coagulase^14,18,19,20. Cibles peuvent être classées en haute affinité et de faible affinité gènes cibles, qui sont probables induit que le niveau de SaeR ~ P augmente lorsqu’ils sont exposés à ses repères²¹. L’activité de SaeR/S est contrôlée par les autres organismes de réglementation de l’expression des gènes tels que le système de détection de quorum Agr, répresseur de protéine de toxines (Rot) et l’autre facteur sigma B (SigB)^22,23,24.

NUC est un gène de virulence de Sae-dépendante chez Staphylococcus aureus et encode la Thermonucléase (Nuc), qui est essentiel pour échapper à neutrophilic emi tpa (filets) et pour la diffusion au cours de la cours de l’infection de^25,26. L’expression du nuc est également fortement indirectement réprimée par CodY en présence d’acides aminés à chaîne ramifiée et GTP²⁷et directement réprimée par la protéine staphylococcique accessoires régulateur SarA^28,29 , dont l’activité est influencée par l’oxygène (état d’oxydoréduction) et pH³⁰. Étant donné que les mutants sae et nuc sont atténués dans les modèles de souris de l’infection, il y a intérêt à développer des interventions chimiques qui inhibent leur correspondant activités^26,31. Malgré cela, il n’y a aucune information au sujet de leur règlement au cours de l’infection.

Fluorescents reporters ont été utilisés pour surveiller et quantifier l’expression des gènes au niveau de la cellule unique. Ici, nous présentons une méthode de quantification de la S. aureus l’expression des gènes au cours de l’infection qui, lorsqu’il est associé avec analyse du transcriptome in vitro et puissantes techniques d’imagerie comme l’imagerie par résonance magnétique (IRM) et la spectroscopie par résonance magnétique (SRM), peuvent révéler comment bactérienne la physiologie est réglementée in vivo et l’abondance relative des éléments nutritifs dans certains créneaux. La méthode peut être appliquée à toute bactérie pathogène avec un système génétique tractable.

Vue d’ensemble du vecteur génomique intégrative.

La génomique intégrative vecteur pRB4 contient 500 paires de bases chaque des régions en amont et en aval de la pseudogène USA300 de Staphylococcus aureus SAUSA300_0087 pour faciliter la recombinaison homologue. pRB4 est dérivé de l’épine dorsale le vecteur thermosensibles pMAD contenant la cassette de résistance à l’érythromycine (ermC) et bêta-galactosidase thermostable gène bgaB pour le dépistage de bleu/blanc de recombinants³². La journaliste ingénierie construction contient également un marqueur de résistance de chloramphénicol (cat) pour la sélection après l’intégration du génome et élimination de plasmide, ainsi que des sites EcoRI et SmaI à fusionner la région régulatrice d’intérêt au vert superfolder protéine fluorescente (sGFP) (Figure 1). On sait que le choix du site de liaison du ribosome (RBS) influe sur l’activité du reporter et exige souvent empiriques optimisation³³. Ainsi, un RBS n’est pas fourni. Ici, le site de fixation du ribosome native est utilisé pour fournir un modèle plus naturel de l’expression des gènes, mais les autres sites peuvent être utilisés.