Для изучения бактериальный ген регулирование в инфицированных тканях метод, основанный на флуоресцирования

Бактерии реагировать на меняющиеся физиологические условия и изменения в состоянии питания их окружающей среды дифференциально выражением генов, необходимых для адаптации и выживания. К примеру оппортунистических патогенов колонизировать тела поверхностей при относительно низкой плотности и зачастую безвредны. Однако после бактерии проникли физические и химические барьеры, он должен бороться с принимающей иммунных клеток борьбе с оборону и ограниченного наличия питательных веществ¹. Например золотистый стафилококк колонизирует приблизительно одну треть населения бессимптомно, но также является причиной разрушительных кожи и инфекций мягких тканей, остеомиелит, эндокардит и бактериемии². Успех S. aureus как возбудитель часто приписывают его метаболические гибкость, а также целый арсенал Факторы вирулентности связанных с поверхности и выделяется, позволяющие бактерии бежать кровоток и реплицировать в периферических тканях ^34,,5. Потому что хост смерть из-за стафилококковых болезней является эволюционным тупик и ограничивает передачу новых хостов⁶, приверженность производства фактор вирулентности должен тщательно контролироваться.

Комплекс нормативных сети белков и некодирующих RNAs реагирует на различные экологические стимулы, включая ячейки плотности, фазы роста, нейтрофилов связанных факторов и наличия питательных веществ, чтобы обеспечить, что генов вирулентности выражаются в Точное время и место в пределах узла ткани^{7,8,9,10,11,12,13}. Например два компонента системы SaeR/S (TCS) регулирует выражение нескольких факторов вирулентности через датчик киназы (SaeS) и ответ регулятор (SaeR)¹⁴. SaeS является autophosphorylated на сохранение гистидина остатков в ответ на принимающей сигналы (например, человеческих нейтрофилов пептидов [HNPs], calprotectin)^8,,1516. Фосфорила группа затем передается аспартат остатков на SaeR, активация его как ДНК связывающих белков (SaeR ~ P)¹⁷. TCS SaeR/S регулирует более 20 генов, которые способствуют патогенеза, включая белки, связывающие фибронектина (FnBPs), лейкоцидины и ванкомицина^14,18,19,20. Цели могут быть классифицированы высокоспецифичные и низкого сродства гена цели, которые, вероятно, индуцированной как уровень SaeR ~ P поднимается при контакте с его сигналы²¹. SaeR/S деятельность контролируется другими регуляторами экспрессии генов, например системы ДЗЗ кворума СМА, репрессор токсинов белка (Rot), и альтернативная Сигма фактор B (SigB)^22,23,24.

КНУ это гена вирулентности Sae зависимых в золотистый стафилококк и кодирует thermonuclease (КНУ), которая необходима для побега от neutrophilic extracellular тударять (сетки), а также для распространения во время курс инфекции^25,26. Выражение КНУ также сильно косвенно репрессирован Коди присутствии разветвленных аминокислот и ГТУ²⁷и непосредственно репрессирован стафилококковых аксессуар регулятор белка Сара^28,29 , деятельность которой находится под влиянием кислорода (окислительно-восстановительного состояния) и рН³⁰. Учитывая, что sae и КНУ мутантов ослабленных в моделях мыши инфекции, есть интерес к разработке химического вмешательства, которые препятствуют их соответствующие мероприятия^26,31. Несмотря на это нет никакой информации относительно их регулирования во время инфекции.

Флуоресцентный Репортеры были использованы для мониторинга и количественной оценки экспрессии генов на уровне одной ячейки. Здесь мы представляем метод количественной оценки S. стафилококк экспрессии генов во время инфекции, когда в паре с в пробирке транскриптом анализ и мощные методы визуализации как магнитно-резонансная томография (МРТ) и магнитно-резонансная спектроскопия (MRS), можно выявить как бактериальный Физиология регулируется в естественных условиях и относительного обилия питательных веществ в определенных нишах. Этот метод может применяться для любых бактериальных патогенов с шансов справиться с возникающими генетической системы.

Обзор генома интегративной вектора.

PRB4 интегративной вектор геном содержит 500 низкопробных пар из вышестоящих и нижестоящих регионов Псевдогены S. aureus USA300 SAUSA300_0087 для облегчения гомологичная рекомбинация. pRB4 является производным от чувствительных к температуре pMAD вектор позвоночник содержащий эритромицин сопротивления кассеты (ermC) и термостабильные бета галактозидазы гена bgaB отбора синий/белый рекомбинантов³². Инженерии репортер конструкции также содержит маркер сопротивления Хлорамфеникол (кошка) для выделения после интеграции генома и плазмиды ликвидации, а также EcoRI и ссии сайты предохранитель регулирования региона, представляющих интерес для superfolder зеленый флуоресцентный белок (sGFP) (рис. 1). Известно, что выбор рибосома привязки сайта (RBS) влияет на деятельность журналиста и часто требует эмпирической оптимизации³³. Таким образом больших двоичных объектов не поддерживается. Здесь родной рибосома привязки сайт используется для предоставления для шаблона более естественный экспрессии генов, но другие сайты могут быть использованы.