Summary

Een fluorescentie gebaseerde methode om te studeren van bacteriële genregulatie in geïnfecteerde weefsels

Published: February 19, 2019
doi:

Summary

Hier wordt beschreven, is een methode voor het analyseren van bacteriële genexpressie in dierlijke weefsels op een cellulair niveau. Deze methode biedt een bron voor de studie van de fenotypische verscheidenheid die zich voordoen binnen een bacteriële bevolking in antwoord op het milieu weefsel tijdens een infectie.

Abstract

Bacteriële virulentiegenen zijn vaak op het transcriptional niveau geregeld door meerdere factoren die inspelen op de verschillende Milieusignalen. Sommige factoren optreden rechtstreeks op virulentiegenen; anderen controleren pathogenese door de uitdrukking van downstream toezichthouders of de accumulatie van signalen die invloed hebben op de activiteit van de regelaar aan te passen. Terwijl de verordening is uitgebreid onderzocht tijdens de in vitro groei, is relatief weinig bekend over hoe genexpressie is geherwaardeerd tijdens de infectie. Dergelijke informatie is belangrijk wanneer het product van een bepaald gen een kandidaat voor therapeutische interventie is. Transcriptionele benaderingen zoals kwantitatieve, real-time RT-PCR en RNA-Seq zijn krachtige methoden voor het onderzoeken van genexpressie op mondiaal niveau maar lijden met vele technische uitdagingen, met inbegrip van lage overvloed van bacteriële RNA vergeleken met host RNA en monster aantasting door RNases. Evaluatie van de verordening met behulp van fluorescerende verslaggevers is relatief eenvoudig en kan worden multiplexed met fluorescerende eiwitten met unieke spectrale eigenschappen. De methode geschikt is voor eencellige, Spatio analyse van genexpressie in weefsels die vertonen complexe driedimensionale architectuur en physiochemical verlopen die invloed hebben op bacteriële regulerende netwerken. Deze informatie gaat verloren wanneer de gegevens zijn gemiddeld over de bevolking van de bulk. Hierin beschrijven we een methode voor de kwantificering van de genexpressie in bacteriële pathogenen in situ. De methode is gebaseerd op eenvoudige weefsel verwerking en directe observatie van fluorescentie van verslaggever eiwitten. We tonen het nut van dit systeem door onderzoek van de expressie van Staphylococcus aureus thermonuclease (NOC), wiens gene product vereist voor immuun belastingontduiking en volledige virulentie ex vivo en in vivo is. We laten zien dat NOC-gfp wordt sterk uitgedrukt in renal abcessen en heterogene genexpressie verschuldigde gedeeltelijk openbaren aan schijnbare ruimtelijke verordening voor NOC promotor activity in abcessen volledig betrokken bij de immuunrespons. De methode kan worden toegepast op elke bacterie met een manipulatable genetische systeem en ieder model van de infectie, verstrekken van waardevolle informatie voor preklinische studies en Geneesmiddelenontwikkeling.

Introduction

Bacteriën reageren op de veranderende fysiologische omstandigheden en veranderingen in de voeding van hun omgeving door het differentieel uiten genen nodig voor aanpassing en overleving. Bijvoorbeeld, koloniseren opportunistische pathogenen lichaam oppervlakken op relatief lage dichtheden, en zijn vaak onschuldig. Echter, zodra de bacterie doorgedrongen de fysische en chemische belemmeringen tot is, moet het kampen met host immuun cel contra verdedigingen en beperkte beschikbaarheid van nutriënten1. Als voorbeeld, Staphylococcus aureus koloniseert ongeveer eenderde van de bevolking asymptomatically, maar is ook de oorzaak van de verwoestende huid en weke delen infecties, osteomyelitis, endocarditis en bacteriëmie2. Het succes van S. aureus als een ziekteverwekker wordt vaak toegeschreven aan de metabole flexibiliteit, alsmede een arsenaal van oppervlak-geassocieerde en secreted virulentiefactoren waarmee de bacterie te ontsnappen van de bloedbaan en repliceren in perifere weefsels 3,4,5. Omdat host overlijden ten gevolge van Staphylococcus ziekte een evolutionaire doodlopende en grenzen overbrenging op nieuwe hosts6 is, moet het streven naar virulentie factor productie zorgvuldig worden gecontroleerd.

Een complexe regelgeving netwerk van eiwitten en niet-coderende RNAs reageert op een verscheidenheid van milieu stimuli, met inbegrip van cel dichtheid, groeifase neutrofiele-geassocieerde factoren en nutriënten beschikbaarheid, om ervoor te zorgen dat virulentiegenen worden uitgedrukt in de precieze tijd en locatie in gastheer weefsel7,8,9,10,11,12,13. Bijvoorbeeld, regelt de SaeR/S 2-componenten systeem (TCS) expressie van verschillende virulentiefactoren via de sensor kinase (SaeS) en de reactie regulator (SaeR)14. SaeS is autophosphorylated op een residu van de geconserveerde histidine in reactie op host signalen (b.v., menselijke neutrofiele peptiden [HNPs], calprotectin)8,15,16. De fosforyl-groep wordt vervolgens overgebracht naar een aspartaat residu op SaeR, activeren als een DNA-bindend-proteïne (SaeR ~ P)17. De SaeR/S TCS regelt meer dan 20 genen die bijdragen aan de pathogenese waaronder fibronectine bindende proteïnen (FnBPs), leukocidins en coagulase14,18,19,20. Doelstellingen kunnen worden ingedeeld in hoge-affiniteit en lage-affiniteit gene doelstellingen, die waarschijnlijk veroorzaakt als het niveau van de SaeR ~ P stijgt wanneer blootgesteld aan haar signalen21. De SaeR/S activiteit wordt beheerd door andere regelgevers van genexpressie zoals de Agr quorum sensing systeem, onderdrukker van toxines eiwitten (Rot), en de alternatieve sigma factor B (SigB)22,23,24.

NOC is een Sae-afhankelijke virulentie gen in Staphylococcus aureus en codeert thermonuclease (NOC), die essentieel is voor het ontsnappen uit neutrophilic extracellular traps (netten) en voor verspreiding tijdens de cursus van infectie25,26. De uitdrukking van NOC is ook sterk indirect onderdrukt door CodY in aanwezigheid van vertakte-keten aminozuren en GTP27, en direct onderdrukt door de Staphylococcus accessoire regelgever proteïne SarA28,29 , waarvan de activiteit wordt beïnvloed door zuurstof (redox staat) en pH30. Gezien het feit dat sae en NOC mutanten zijn verzwakt in muismodellen van infectie, is er interesse in de ontwikkeling van chemische interventies die een remmende werking van hun overeenkomstige activiteiten26,31. Ondanks dit is er geen informatie met betrekking tot hun verordening tijdens de infectie.

Fluorescerende verslaggevers werden gebruikt om te controleren en te kwantificeren van genexpressie op het niveau van één cel. Hierin presenteren wij een methode voor de kwantificering van S. aureus genexpressie gedurende infectie die, wanneer in paren gerangschikt met in vitro transcriptome analyse en krachtige imaging technieken zoals magnetische resonantie beeldvorming (MRI) en magnetische resonantie spectroscopie (MRS), kan onthullen hoe bacteriële Fysiologie is geregeld in vivo en de relatieve abundanties van voedingsstoffen in bepaalde niches. De methode kan worden toegepast op eventuele bacteriële pathogenen met een hanteerbare genetische systeem.

Overzicht van het genoom integratieve vector.

Het genoom integratieve vector pRB4 bevat 500 basenparen elk van de upstream- en downstream regio’s van de S. aureus USA300 SAUSA300_0087 pseudogene te vergemakkelijken van homologe recombinatie. pRB4 is afgeleid van de temperatuurgevoelige pMAD vector ruggengraat met de erythromycine weerstand cassette (ermC) en de thermostable beta-galactosidase gene bgaB voor blauw/wit screening van recombinanten32. De gemanipuleerde verslaggever construct bevat ook een chlooramfenicol weerstand marker (kat) voor selectie na genoom integratie en uitbanning van de plasmide, evenals EcoRI en SmaI sites om te fuseren de regelgevende regio van belang zijn voor superfolder groen fluorescente proteïne (sGFP) (Figuur 1). Het is bekend dat de keuze van ribosoom bindende site (RBS) de activiteit van de verslaggever beïnvloedt, en vaak empirische optimalisatie33 vereist. Dus, een RBS wordt niet geleverd. Hier is de inheemse ribosoom bindende site wordt gebruikt om te voorzien in een meer natuurlijke patroon van genexpressie, maar andere sites mogen worden gebruikt.

Protocol

Alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van de Universiteit van Georgetown. 1. generatie van de fluorescerende verslaggever stam De genoom integratieve pRB4 vector opeenvolgend met EcoRI en SmaI restrictie-enzymen verteren. Volgens de fabrikant protocol, opzetten van een overnachting spijsvertering met SmaI met behulp van 1 microgram van pRB4 bij 25 ° C, en ga vervolgens verder met de tweede spijsverteri…

Representative Results

We ontwikkelden een plasmide afgeleid van pMAD32 , die een verslaggever leveren kan fusion constructie in het chromosoom door dubbele crossover homologe recombinatie (Figuur 1). Deze constructie zorgt voor de kwantitatieve analyse van alle regelgevende regio die ondersteuning biedt voor de productie van GFP eiwit en fluorescent signaal boven achtergrond. Het plasmide verleent ampicilline-resistentie (Apr) voor onderhoud en v…

Discussion

Bacteriële infectieziekten zijn een toenemend gezondheidsprobleem wereldwijd als gevolg van de overname van antibioticaresistentie determinanten46. Omdat aanpassing aan de host-omgevingen essentieel voor groei en overleving tijdens de infectie is, kunnen strategieën gericht op gen expressie programma’s waardoor pathogen fitness nuttig therapeutisch. Een dergelijk programma is de verzameling van genen gecontroleerd door de SaeR/S 2-componenten systeem (TCS), om te spelen een essentiële rol bij i…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wij danken Alexander Horswill voor de gave van de PsarAP1– tdTomato fusion, en Karen Creswell voor hulp bij stroom cytometry analyse. Wij danken ook Alyssa King voor advies over statistische analyse. Dit werk werd gedeeltelijk gefinancierd door een NIH exploratiepremies/Developmental Research Award (grant AI123708) en SRB fondsen faculteit opstarten. De financiers had geen rol in de studie ontwerp, gegevensverzameling en interpretatie, of de beslissing tot het indienen van het werk voor publicatie.

Materials

5% sheep blood Hardy Diagnostics (Santa Maria, CA) A10
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal) ThermoScientific R0402
Ampicillin Fisher Scientific BP1760-25
C57Bl/6 Mice Charles River NA
Chloramphenicol Sigma-Aldrich C-0378
confocal laser scanning microscope Zeiss NA
cryostat microtome Thermo Scientific NA
Culture, Cap VWR International 2005-02512
D+2:25NA Oligo Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa) NA
DNA Ligase New England Biolabs M0202S
Erythromycin Sigma-Aldrich E5389
Flow Analyzer Becton Dickinson NA
glass beads Sigma Z273627
Miniprep, plasmid Promega A1220
orbital shaking water bath New Brunswick Innova NA
PCR purification QIagen 28106
Phosphate Buffer Saline (PBS) Cellgrow 46-013-CM
Plate reader Tecan NA
Precellys 24 homogenizer Bertin Laboratories NA
pUC57-Kan GenScript (Piscataway, NJ) NA
Q5 Taq DNA Polymerase New England Biolabs (Ipswich, MA) M0491S
Restriction Enzymes New England Biolabs (Ipswich, MA) R0150S (PvuI), R3136S (BamHI), R0144S (BglII), R3131S (NheI), R0101S (EcoRI), R0141S (SmaI).
Reverse transcriptase New England BioLabs E6300L
Sanger Sequencing Genewiz (Germantown, MD) NA
Sub Xero clear tissue freezing medium Mercedes Medical MER5000
Superfrost Plus microscope slides Fisher Scientific 12-550-15
superloop GE Lifesciences 18111382
Syringe, Filter VWR International 28145-481
Syto 40 Thermo Fisher Scientific S11351 Membrane permeant nucleic acid stain
Tetracycline Sigma-Aldrich T7660
Tryptic Soy Broth VWR 90000-376
UV-visible spectrophotometer Beckman Coulter-DU350 NA
Vectashield Antifade Mounting medium with DAPI Vector Laboratories H-1500

References

  1. Hood, M. I., Skaar, E. P. Nutritional immunity: transition metals at the pathogen-host interface. Nature Reviews Microbiology. 10 (8), 525-537 (2012).
  2. Lowy, F. Staphylococcus aureus infections. The New England Journal of Medicine. 339 (8), 520-532 (1998).
  3. Grosser, M. R., et al. Genetic requirements for Staphylococcus aureus nitric oxide resistance and virulence. PLoS Pathogen. 14 (3), 1006907 (2018).
  4. Valentino, M., et al. Genes contributing to Staphylococcus aureus fitness in abscess- and infection-related ecologies. MBio. 5 (5), 01714-01729 (2014).
  5. Cheng, A., et al. Genetic requirements for Staphylococcus aureus abscess formation and persistence in host tissues. FASEB Journal. 23 (10), 3393-3404 (2009).
  6. Meyers, L. A., Levin, B. R., Richardson, A. R., Stojiljkovic, I. Epidemiology, hypermutation, within-host evolution and the virulence of Neisseria meningitidis. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 270 (1525), 1667-1677 (2003).
  7. Balasubramanian, D., et al. Staphylococcus aureus Coordinates Leukocidin Expression and Pathogenesis by Sensing Metabolic Fluxes via RpiRc. MBio. 7 (3), 00818 (2016).
  8. Geiger, T., Goerke, C., Mainiero, M., Kraus, D., Wolz, C. The virulence regulator Sae of Staphylococcus aureus.: promoter activities and response to phagocytosis-related signals. Journal of Bacteriology. 190 (10), 3419-3428 (2008).
  9. Weiss, A., Broach, W. H., Shaw, L. N. Characterizing the transcriptional adaptation of Staphylococcus aureus. to stationary phase growth. Pathogens and Disease. 74 (5), (2016).
  10. Balaban, N., Novick, R. P. Autocrine regulation of toxin synthesis by Staphylococcus aureus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (5), 1619-1623 (1995).
  11. Pohl, K., et al. CodY in Staphylococcus aureus: a regulatory link between metabolism and virulence gene expression. Journal of Bacteriology. 191 (9), 2953-2963 (2009).
  12. Majerczyk, C. D., et al. Staphylococcus aureus CodY negatively regulates virulence gene expression. Journal of Bacteriology. 190 (7), 2257-2265 (2008).
  13. McNamara, P. J., Milligan-Monroe, K. C., Khalili, S., Proctor, R. A. Identification, cloning, and initial characterization of rot, a locus encoding a regulator of virulence factor expression in Staphylococcus aureus. Journal of Bacteriology. 182 (11), 3197-3203 (2000).
  14. Liu, Q., Yeo, W. S., Bae, T. The SaeRS Two-Component System of Staphylococcus aureus. Genes (Basel). 7 (10), 81 (2016).
  15. Giraudo, A., Calzolari, A., Cataldi, A., Bogni, C., Nagel, R. The sae locus of Staphylococcus aureus encodes a two-component regulatory system. FEMS Microbiology Letters. 177 (1), 15-22 (1999).
  16. Cho, H., et al. Calprotectin Increases the Activity of the SaeRS Two Component System and Murine Mortality during Staphylococcus aureus Infections. PLoS Pathogen. 11 (7), 1005026 (2015).
  17. Sun, F., et al. In the Staphylococcus aureus two-component system sae, the response regulator SaeR binds to a direct repeat sequence and DNA binding requires phosphorylation by the sensor kinase SaeS. Journal of Bacteriology. 192 (8), 2111-2127 (2010).
  18. Liang, X., et al. Inactivation of a two-component signal transduction system, SaeRS, eliminates adherence and attenuates virulence of Staphylococcus aureus. Infection and Immunity. 74 (8), 4655-4665 (2006).
  19. Giraudo, A. T., Cheung, A. L., Nagel, R. The sae locus of Staphylococcus aureus controls exoprotein synthesis at the transcriptional level. Archives of Microbiology. 168 (1), 53-58 (1997).
  20. Flack, C. E., et al. Differential regulation of staphylococcal virulence by the sensor kinase SaeS in response to neutrophil-derived stimuli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (19), 2037-2045 (2014).
  21. Mainiero, M., et al. Differential target gene activation by the Staphylococcus aureus two-component system saeRS. Journal of Bacteriology. 192 (3), 613-623 (2010).
  22. Li, D., Cheung, A. Repression of hla by rot is dependent on sae in Staphylococcus aureus. Infection and Immunity. 76 (3), 1068-1075 (2008).
  23. Bischoff, M., et al. Microarray-based analysis of the Staphylococcus aureus sigmaB regulon. Journal of Bacteriology. 186 (13), 4085-4099 (2004).
  24. Novick, R., Jiang, D. The staphylococcal saeRS system coordinates environmental signals with agr quorum sensing. Microbiology. 149, 2709-2717 (2003).
  25. Olson, M. E., et al. Staphylococcus aureus nuclease is an SaeRS-dependent virulence factor. Infection and Immunity. 81 (4), 1316-1324 (2013).
  26. Berends, E., et al. Nuclease expression by Staphylococcus aureus facilitates escape from neutrophil extracellular traps. Journal of Innate Immunity. 2 (6), 576-587 (2010).
  27. Waters, N. R., et al. A spectrum of CodY activities drives metabolic reorganization and virulence gene expression in Staphylococcus aureus. Molecular Microbiology. 101 (3), 495-514 (2016).
  28. Cassat, J., et al. Transcriptional profiling of a Staphylococcus aureus clinical isolate and its isogenic agr and sarA mutants reveals global differences in comparison to the laboratory strain RN6390. Microbiology. 152, 3075-3090 (2006).
  29. Kiedrowski, M., et al. Nuclease modulates biofilm formation in community-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus. PLoS One. 6 (11), 26714 (2011).
  30. Fujimoto, D. F., et al. Staphylococcus aureus SarA is a regulatory protein responsive to redox and pH that can support bacteriophage lambda integrase-mediated excision/recombination. Molecular Microbiology. 74 (6), 1445-1458 (2009).
  31. Yeo, W. S., et al. The FDA-approved anti-cancer drugs, streptozotocin and floxuridine, reduce the virulence of Staphylococcus aureus. Scientific Reports. 8 (1), 2521 (2018).
  32. Arnaud, M., Chastanet, A., Débarbouillé, M. New vector for efficient allelic replacement in naturally nontransformable, low-GC-content, Gram-positive bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 70 (11), 6887-6891 (2004).
  33. Malone, C. L., et al. Fluorescent reporters for Staphylococcus aureus. Journal of Microbiological Methods. 77 (3), 251-260 (2009).
  34. Schenk, S., Laddaga, R. A. Improved method for electroporation of Staphylococcus aureus. FEMS Microbiology Letters. 73 (1-2), 133-138 (1992).
  35. Monk, I. R., Foster, T. J. Genetic manipulation of Staphylococci-breaking through the barrier. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 2, 49 (2012).
  36. Novick, R. P. Genetic systems in staphylococci. Methods in Enzymology. 204, 587-636 (1991).
  37. Diep, B. A., et al. Complete genome sequence of USA300, an epidemic clone of community-acquired meticillin-resistant Staphylococcus aureus. Lancet. 367 (9512), 731-739 (2006).
  38. Boles, B. R., Thoendel, M., Roth, A. J., Horswill, A. R. Identification of genes involved in polysaccharide-independent Staphylococcus aureus biofilm formation. PLoS One. 5 (4), 10146 (2010).
  39. Villaruz, A. E., et al. A point mutation in the agr locus rather than expression of the Panton-Valentine leukocidin caused previously reported phenotypes in Staphylococcus aureus pneumonia and gene regulation. Journal of Infect Diseases. 200 (5), 724-734 (2009).
  40. Reeves, P. G., Nielsen, F. H., Fahey, G. C. J. AIN-93 purified diets for laboratory rodents: final report of the American Institute of Nutrition ad hoc writing committee on the reformulation of the AIN-76A rodent diet. Journal of Nutrition. 123 (11), 1939-1951 (1993).
  41. Thomer, L., Schneewind, O., Missiakas, D. Pathogenesis of Staphylococcus aureus Bloodstream Infections. Annual Review of Pathology. 11, 343-364 (2016).
  42. Olson, M., et al. Staphylococcus aureus nuclease is an SaeRS-dependent virulence factor. Infection and Immunity. 81 (4), 1316-1324 (2013).
  43. Thammavongsa, V., Missiakas, D., Schneewind, O. Staphylococcus aureus degrades neutrophil extracellular traps to promote immune cell death. Science. 342 (6160), 863-866 (2013).
  44. Cheung, A. L., Nast, C. C., Bayer, A. S. Selective activation of sar promoters with the use of green fluorescent protein transcriptional fusions as the detection system in the rabbit endocarditis model. Infection and Immunity. 66 (12), 5988-5993 (1998).
  45. Pilsczek, F. H., et al. A novel mechanism of rapid nuclear neutrophil extracellular trap formation in response to Staphylococcus aureus. Journal of Immunology. 185 (12), 7413-7425 (2010).
  46. Uhlemann, A. C., Otto, M., Lowy, F. D., DeLeo, F. R. Evolution of community- and healthcare-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Infection, Genetics and Evolution. 21, 563-574 (2014).
  47. Voyich, J. M., et al. The SaeR/S gene regulatory system is essential for innate immune evasion by Staphylococcus aureus. Journal of Infectious Diseases. 199 (11), 1698-1706 (2009).
  48. Cheng, A., DeDent, A., Schneewind, O., Missiakas, D. A play in four acts: Staphylococcus aureus. abscess formation. Trends in Microbiology. 19 (5), 225-232 (2011).
  49. Balasubramanian, D., Harper, L., Shopsin, B., Torres, V. J. Staphylococcus aureus pathogenesis in diverse host environments. Pathogens and Disease. 75 (1), (2017).
  50. Vitko, N. P., Grosser, M. R., Khatri, D., Thurlow, L. R., Richardson, A. R. Expanded Glucose Import Capability Affords Staphylococcus aureus Optimized Glycolytic Flux during Infection. MBio. 7 (3), 00296 (2016).
  51. Landete, J. M., et al. Use of anaerobic green fluorescent protein versus green fluorescent protein as reporter in lactic acid bacteria. Applied Microbiology and Biotechnol. 99 (16), 6865-6877 (2015).
  52. Buckley, A. M., et al. Lighting Up Clostridium Difficile: Reporting Gene Expression Using Fluorescent Lov Domains. Scientific Reports. 6, 23463 (2016).
  53. Bose, J. L. Genetic manipulation of staphylococci. Methods in Molecular Biology. 1106, 101-111 (2014).
  54. Krute, C. N., et al. Generation of a stable plasmid for in vitro and in vivo studies of Staphylococcus. Applied and Environmental Microbiology. , 02370 (2016).
  55. Cassat, J. E., et al. Integrated molecular imaging reveals tissue heterogeneity driving host-pathogen interactions. Science Translational Medicine. 10 (432), 6361 (2018).
  56. Handlogten, M. E., Hong, S. P., Westhoff, C. M., Weiner, I. D. Apical ammonia transport by the mouse inner medullary collecting duct cell (mIMCD-3). American Journal of Physiology-Renal Physiology. 289 (2), 347-358 (2005).
  57. Hijmans, B. S., Grefhorst, A., Oosterveer, M. H., Groen, A. K. Zonation of glucose and fatty acid metabolism in the liver: mechanism and metabolic consequences. Biochimie Journal. 96, 121-129 (2014).
  58. Davis, K. M., Mohammadi, S., Isberg, R. R. Community behavior and spatial regulation within a bacterial microcolony in deep tissue sites serves to protect against host attack. Cell Host & Microbe. 17 (1), 21-31 (2015).
  59. Stenman, J. M., et al. Canonical Wnt signaling regulates organ-specific assembly and differentiation of CNS vasculature. Science. 322 (5905), 1247-1250 (2008).

Play Video

Cite This Article
Behera, R. K., Mlynek, K. D., Linz, M. S., Brinsmade, S. R. A Fluorescence-based Method to Study Bacterial Gene Regulation in Infected Tissues. J. Vis. Exp. (144), e59055, doi:10.3791/59055 (2019).

View Video