Hier wordt beschreven, is een methode voor het analyseren van bacteriële genexpressie in dierlijke weefsels op een cellulair niveau. Deze methode biedt een bron voor de studie van de fenotypische verscheidenheid die zich voordoen binnen een bacteriële bevolking in antwoord op het milieu weefsel tijdens een infectie.
Bacteriële virulentiegenen zijn vaak op het transcriptional niveau geregeld door meerdere factoren die inspelen op de verschillende Milieusignalen. Sommige factoren optreden rechtstreeks op virulentiegenen; anderen controleren pathogenese door de uitdrukking van downstream toezichthouders of de accumulatie van signalen die invloed hebben op de activiteit van de regelaar aan te passen. Terwijl de verordening is uitgebreid onderzocht tijdens de in vitro groei, is relatief weinig bekend over hoe genexpressie is geherwaardeerd tijdens de infectie. Dergelijke informatie is belangrijk wanneer het product van een bepaald gen een kandidaat voor therapeutische interventie is. Transcriptionele benaderingen zoals kwantitatieve, real-time RT-PCR en RNA-Seq zijn krachtige methoden voor het onderzoeken van genexpressie op mondiaal niveau maar lijden met vele technische uitdagingen, met inbegrip van lage overvloed van bacteriële RNA vergeleken met host RNA en monster aantasting door RNases. Evaluatie van de verordening met behulp van fluorescerende verslaggevers is relatief eenvoudig en kan worden multiplexed met fluorescerende eiwitten met unieke spectrale eigenschappen. De methode geschikt is voor eencellige, Spatio analyse van genexpressie in weefsels die vertonen complexe driedimensionale architectuur en physiochemical verlopen die invloed hebben op bacteriële regulerende netwerken. Deze informatie gaat verloren wanneer de gegevens zijn gemiddeld over de bevolking van de bulk. Hierin beschrijven we een methode voor de kwantificering van de genexpressie in bacteriële pathogenen in situ. De methode is gebaseerd op eenvoudige weefsel verwerking en directe observatie van fluorescentie van verslaggever eiwitten. We tonen het nut van dit systeem door onderzoek van de expressie van Staphylococcus aureus thermonuclease (NOC), wiens gene product vereist voor immuun belastingontduiking en volledige virulentie ex vivo en in vivo is. We laten zien dat NOC-gfp wordt sterk uitgedrukt in renal abcessen en heterogene genexpressie verschuldigde gedeeltelijk openbaren aan schijnbare ruimtelijke verordening voor NOC promotor activity in abcessen volledig betrokken bij de immuunrespons. De methode kan worden toegepast op elke bacterie met een manipulatable genetische systeem en ieder model van de infectie, verstrekken van waardevolle informatie voor preklinische studies en Geneesmiddelenontwikkeling.
Bacteriën reageren op de veranderende fysiologische omstandigheden en veranderingen in de voeding van hun omgeving door het differentieel uiten genen nodig voor aanpassing en overleving. Bijvoorbeeld, koloniseren opportunistische pathogenen lichaam oppervlakken op relatief lage dichtheden, en zijn vaak onschuldig. Echter, zodra de bacterie doorgedrongen de fysische en chemische belemmeringen tot is, moet het kampen met host immuun cel contra verdedigingen en beperkte beschikbaarheid van nutriënten1. Als voorbeeld, Staphylococcus aureus koloniseert ongeveer eenderde van de bevolking asymptomatically, maar is ook de oorzaak van de verwoestende huid en weke delen infecties, osteomyelitis, endocarditis en bacteriëmie2. Het succes van S. aureus als een ziekteverwekker wordt vaak toegeschreven aan de metabole flexibiliteit, alsmede een arsenaal van oppervlak-geassocieerde en secreted virulentiefactoren waarmee de bacterie te ontsnappen van de bloedbaan en repliceren in perifere weefsels 3,4,5. Omdat host overlijden ten gevolge van Staphylococcus ziekte een evolutionaire doodlopende en grenzen overbrenging op nieuwe hosts6 is, moet het streven naar virulentie factor productie zorgvuldig worden gecontroleerd.
Een complexe regelgeving netwerk van eiwitten en niet-coderende RNAs reageert op een verscheidenheid van milieu stimuli, met inbegrip van cel dichtheid, groeifase neutrofiele-geassocieerde factoren en nutriënten beschikbaarheid, om ervoor te zorgen dat virulentiegenen worden uitgedrukt in de precieze tijd en locatie in gastheer weefsel7,8,9,10,11,12,13. Bijvoorbeeld, regelt de SaeR/S 2-componenten systeem (TCS) expressie van verschillende virulentiefactoren via de sensor kinase (SaeS) en de reactie regulator (SaeR)14. SaeS is autophosphorylated op een residu van de geconserveerde histidine in reactie op host signalen (b.v., menselijke neutrofiele peptiden [HNPs], calprotectin)8,15,16. De fosforyl-groep wordt vervolgens overgebracht naar een aspartaat residu op SaeR, activeren als een DNA-bindend-proteïne (SaeR ~ P)17. De SaeR/S TCS regelt meer dan 20 genen die bijdragen aan de pathogenese waaronder fibronectine bindende proteïnen (FnBPs), leukocidins en coagulase14,18,19,20. Doelstellingen kunnen worden ingedeeld in hoge-affiniteit en lage-affiniteit gene doelstellingen, die waarschijnlijk veroorzaakt als het niveau van de SaeR ~ P stijgt wanneer blootgesteld aan haar signalen21. De SaeR/S activiteit wordt beheerd door andere regelgevers van genexpressie zoals de Agr quorum sensing systeem, onderdrukker van toxines eiwitten (Rot), en de alternatieve sigma factor B (SigB)22,23,24.
NOC is een Sae-afhankelijke virulentie gen in Staphylococcus aureus en codeert thermonuclease (NOC), die essentieel is voor het ontsnappen uit neutrophilic extracellular traps (netten) en voor verspreiding tijdens de cursus van infectie25,26. De uitdrukking van NOC is ook sterk indirect onderdrukt door CodY in aanwezigheid van vertakte-keten aminozuren en GTP27, en direct onderdrukt door de Staphylococcus accessoire regelgever proteïne SarA28,29 , waarvan de activiteit wordt beïnvloed door zuurstof (redox staat) en pH30. Gezien het feit dat sae en NOC mutanten zijn verzwakt in muismodellen van infectie, is er interesse in de ontwikkeling van chemische interventies die een remmende werking van hun overeenkomstige activiteiten26,31. Ondanks dit is er geen informatie met betrekking tot hun verordening tijdens de infectie.
Fluorescerende verslaggevers werden gebruikt om te controleren en te kwantificeren van genexpressie op het niveau van één cel. Hierin presenteren wij een methode voor de kwantificering van S. aureus genexpressie gedurende infectie die, wanneer in paren gerangschikt met in vitro transcriptome analyse en krachtige imaging technieken zoals magnetische resonantie beeldvorming (MRI) en magnetische resonantie spectroscopie (MRS), kan onthullen hoe bacteriële Fysiologie is geregeld in vivo en de relatieve abundanties van voedingsstoffen in bepaalde niches. De methode kan worden toegepast op eventuele bacteriële pathogenen met een hanteerbare genetische systeem.
Overzicht van het genoom integratieve vector.
Het genoom integratieve vector pRB4 bevat 500 basenparen elk van de upstream- en downstream regio’s van de S. aureus USA300 SAUSA300_0087 pseudogene te vergemakkelijken van homologe recombinatie. pRB4 is afgeleid van de temperatuurgevoelige pMAD vector ruggengraat met de erythromycine weerstand cassette (ermC) en de thermostable beta-galactosidase gene bgaB voor blauw/wit screening van recombinanten32. De gemanipuleerde verslaggever construct bevat ook een chlooramfenicol weerstand marker (kat) voor selectie na genoom integratie en uitbanning van de plasmide, evenals EcoRI en SmaI sites om te fuseren de regelgevende regio van belang zijn voor superfolder groen fluorescente proteïne (sGFP) (Figuur 1). Het is bekend dat de keuze van ribosoom bindende site (RBS) de activiteit van de verslaggever beïnvloedt, en vaak empirische optimalisatie33 vereist. Dus, een RBS wordt niet geleverd. Hier is de inheemse ribosoom bindende site wordt gebruikt om te voorzien in een meer natuurlijke patroon van genexpressie, maar andere sites mogen worden gebruikt.
Bacteriële infectieziekten zijn een toenemend gezondheidsprobleem wereldwijd als gevolg van de overname van antibioticaresistentie determinanten46. Omdat aanpassing aan de host-omgevingen essentieel voor groei en overleving tijdens de infectie is, kunnen strategieën gericht op gen expressie programma’s waardoor pathogen fitness nuttig therapeutisch. Een dergelijk programma is de verzameling van genen gecontroleerd door de SaeR/S 2-componenten systeem (TCS), om te spelen een essentiële rol bij i…
The authors have nothing to disclose.
Wij danken Alexander Horswill voor de gave van de PsarAP1– tdTomato fusion, en Karen Creswell voor hulp bij stroom cytometry analyse. Wij danken ook Alyssa King voor advies over statistische analyse. Dit werk werd gedeeltelijk gefinancierd door een NIH exploratiepremies/Developmental Research Award (grant AI123708) en SRB fondsen faculteit opstarten. De financiers had geen rol in de studie ontwerp, gegevensverzameling en interpretatie, of de beslissing tot het indienen van het werk voor publicatie.
5% sheep blood | Hardy Diagnostics (Santa Maria, CA) | A10 | |
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal) | ThermoScientific | R0402 | |
Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-25 | |
C57Bl/6 Mice | Charles River | NA | |
Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C-0378 | |
confocal laser scanning microscope | Zeiss | NA | |
cryostat microtome | Thermo Scientific | NA | |
Culture, Cap | VWR International | 2005-02512 | |
D+2:25NA Oligo | Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa) | NA | |
DNA Ligase | New England Biolabs | M0202S | |
Erythromycin | Sigma-Aldrich | E5389 | |
Flow Analyzer | Becton Dickinson | NA | |
glass beads | Sigma | Z273627 | |
Miniprep, plasmid | Promega | A1220 | |
orbital shaking water bath | New Brunswick Innova | NA | |
PCR purification | QIagen | 28106 | |
Phosphate Buffer Saline (PBS) | Cellgrow | 46-013-CM | |
Plate reader | Tecan | NA | |
Precellys 24 homogenizer | Bertin Laboratories | NA | |
pUC57-Kan | GenScript (Piscataway, NJ) | NA | |
Q5 Taq DNA Polymerase | New England Biolabs (Ipswich, MA) | M0491S | |
Restriction Enzymes | New England Biolabs (Ipswich, MA) | R0150S (PvuI), R3136S (BamHI), R0144S (BglII), R3131S (NheI), R0101S (EcoRI), R0141S (SmaI). | |
Reverse transcriptase | New England BioLabs | E6300L | |
Sanger Sequencing | Genewiz (Germantown, MD) | NA | |
Sub Xero clear tissue freezing medium | Mercedes Medical | MER5000 | |
Superfrost Plus microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
superloop | GE Lifesciences | 18111382 | |
Syringe, Filter | VWR International | 28145-481 | |
Syto 40 | Thermo Fisher Scientific | S11351 | Membrane permeant nucleic acid stain |
Tetracycline | Sigma-Aldrich | T7660 | |
Tryptic Soy Broth | VWR | 90000-376 | |
UV-visible spectrophotometer | Beckman Coulter-DU350 | NA | |
Vectashield Antifade Mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 |